一种靶向型多肽纳米基因载体复合物制造技术

本发明专利技术涉及基因载体领域，具体公开了一种靶向型多肽纳米基因载体复合物，由带正电荷的纳米基因载体、基因药物和具备肿瘤靶向的抗体构成，所述纳米基因载体上吸附有基因药物和具备肿瘤靶向的抗体，所述纳米基因载体由多肽和疏水性功能分子偶联构成。本发明专利技术通过自组装形成纳米基因载体并携带小干扰核酸，表面吸附靶向肿瘤组织的抗体，利用带丰富正电荷的纳米基因载体吸附具有靶向性、带负电的抗体，可避免带正电的纳米基因载体在体内循环中被清除，同时又能提高靶向能力。该方法过程简单，反应条件温和，易于操作。不仅如此，所述自组装过程中不生成共价健，没有逆反应，可形成高度有序的纳米结构，特别适合于构建生物医用材料。

Targeting type polypeptide nano gene carrier complex

The present invention relates to a gene vector field, specifically discloses a targeting peptide nano gene carrier composite, composed of nano gene vector, the positively charged with drug and gene targeting antibodies, the nano gene vector with gene and antibody drug adsorption with tumor targeting, the nano gene the carrier by peptide and hydrophobic functional molecular coupling structure. The invention is formed through the self-assembly of nano gene carrier carrying small interfering RNA and antibody adsorbed on the surface of tumor targeting, antibody with nano gene carrier rich in positive charge adsorption has targeted, negatively charged, can avoid the positively charged nano gene vector cleared in vivo circulation, but also can improve the target the ability to. The process is simple, the reaction conditions are mild and easy to operate. Moreover, no covalent reaction exists during the self-assembly process, and no reverse reaction can be used to form highly ordered nanostructures, which is particularly suitable for constructing biomedical materials.

【技术实现步骤摘要】
一种靶向型多肽纳米基因载体复合物
本专利技术涉及基因载体领域，具体地说，涉及一种靶向型多肽纳米基因载体复合物。
技术介绍
基因治疗是将基因(主要为DNA或siRNA)传递到特定细胞中，从而促进或抑制目标蛋白的表达，达到治疗人类疾病的目的，由于DNA或siRNA容易被核酸酶降解，并且多带负电荷导致其难以通过同样带负电荷的细胞膜，故需要利用基因载体来保护并传递核酸进入细胞内。理想的基因载体应该保证高转染效率的同时，具有良好的生物相容性和较低的细胞毒性，除此之外，对特定细胞类型的转染也是基因载体需要具备的特征之一。因此，发展具有高效、低毒且具有靶向功能的基因载体是基因治疗成功应用的重要前提。基因载体分病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体虽然具备高转染效率的优点，却存在很大的安全隐患，高免疫原性可引起机体免疫原性，并且存在激活原癌基因引发肿瘤的风险。非病毒载体的优势在于免疫原性低，生产制备简单，对基因材料要求限制少等。非病毒载体分为聚合物和脂质体两大类，前者包括聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚氨基酸、树枝状大分子等；后者以阳离子脂质体为代表。这些载体的共同特点是都带有大量正电荷，通过静电吸附作用携带基因物质。聚乙烯亚胺是一种转染效率高且被广泛应用的基因载体材料，但由于它不可降解，毒性大等原因抑制了其在体内的应用。近年来，生物可降解的聚阳离子材料渐渐引起了研究者的关注。相比不可降解的聚合物材料，多肽及其衍生物类材料由于其类蛋白质的组成，具有低毒低富集，生物相容性好的特点，有望成为理想的基因载体。随着分子生物学技术的迅猛发展和人类对肿瘤发病机制认识的不断深入，基因治疗逐渐成为肿瘤生物学治疗中的重要组成部分。而对体内特定细胞类型的基因转染是基因治疗可以成功的关键因素。近年来，肿瘤微环境中的非肿瘤细胞成分，如肿瘤相关成纤维细胞，血管内皮细胞，肿瘤相关巨噬细胞逐渐引起了人们的关注。针对肿瘤间质细胞的基因治疗，阻碍间质细胞对肿瘤发生发展的促进作用，从而达到辅助常规治疗办法的手段是一种很有应用前景的策略。CN102114000A公开了一种同时包载抗癌多肽和基因或化疗药物或放疗药物的共输送脂质纳米递药系统。所述递药系统由寻靶材料、脂质成分和药物组成，其充分利用组分间的性状差异，或通过静电吸附进行包载，或通过被动结合主动载药的方法，实现将不同药物共同包载到脂质纳米递药系统中，将可恢复抑癌蛋白p53活性的抗癌多肽和基因药物或化疗药物或放疗药物同时递送入靶细胞内，达到协同治疗的目的。然而，该专利技术所述纳米递药系统存在构建步骤复杂，靶向修饰过程繁琐，靶向修饰合成效率低等问题，且脂质体稳定性有待改进，限制了其进一步应用。CN104288776A公开了一种自组装多肽—凋亡素基因复合纳米颗粒及其制备方法和应用。所述的自组装多肽—凋亡素基因复合纳米颗粒是由自组装多肽作为载体，通过自身的酸性氨基酸和碱性氨基酸所带的电荷与携带凋亡素基因的质粒分子之间形成离子键结合，质粒分子牢固粘附于自组装多肽表面，形成复合纳米颗粒。该复合纳米颗粒呈纤维状，长度为100～200nm，直径为10～20nm。该纳米颗粒表面富含精氨酸，能与细胞膜表面精氨酸受体识别结合并被细胞摄取，在细胞内表达其所携带的基因，所表达的凋亡素蛋白能特异性诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒。然而，其由于所公布的载体无靶向性，所述精氨酸受体无特异性，限制了其对特定细胞的靶向转染和生物体内转染。因此，亟需开发一种高效、低毒、制备简易且具备肿瘤靶向作用的多肽纳米基因载体复合物。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种靶向型多肽纳米基因载体复合物(PNP/DNA/抗体复合物或PNP/siRNA/抗体复合物)。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术首先提供了一种具备肿瘤靶向作用的多肽纳米基因载体复合物，其由带正电荷的纳米基因载体、基因药物和具备肿瘤靶向的抗体构成；所述纳米基因载体上吸附有基因药物和具备肿瘤靶向的抗体；所述纳米基因载体由多肽和疏水性功能分子偶联构成。作为优选，多肽与基因药物的正负电荷比(N:P)为20:1～50:1。其中，所述基因药物为siRNA和/或DNA。进一步地，所述多肽为分子量在1.5kDa～4kDa之间两亲性穿膜肽，优选为多聚精氨酸；所述疏水性功能分子为胆固醇。作为优选，多肽与抗体的质量比为10:1-5:1。作为优选，所述纳米基因载体的粒径在50～110nm之间。进一步地，所述多肽纳米基因载体复合物的制备方法为：(1)将多肽和疏水性功能分子偶联构成的两亲性结合物溶解在少量二甲基亚砜中使其充分分散，取少量上述二甲基亚砜溶液加入水(或磷酸盐缓冲液)中在100W超声条件下超声5-10min，自组装得到带正电荷的纳米基因载体；上述二甲基亚砜溶液加入水(或磷酸盐缓冲液)后的体系中，两亲性结合物的浓度不低于32.4mgL-1；考虑到二甲基亚砜对细胞的毒性，二甲基亚砜在该体系中质量比不应超过1％；(2)将基因药物的水溶液与步骤(1)所得溶液混合，室温静置20～30min，通过静电吸附作用形成纳米基因载体与基因药物的复合物；(3)向步骤(2)所得溶液中加入抗体，室温孵育，通过静电吸附作用形成多肽纳米基因载体复合物。进一步地，所述抗体为靶向肿瘤间质细胞的抗体，优选为抗成纤维细胞活化蛋白抗体(anti-FAP-α)。本专利技术涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。本专利技术的有益效果在于：本专利技术通过自组装形成纳米基因载体并携带小干扰核酸，表面吸附靶向肿瘤组织的抗体。利用带丰富正电荷的纳米基因载体吸附具有靶向性、带负电的抗体，可避免带正电的纳米基因载体在体内循环中被清除，同时又能提高靶向能力。该方法过程简单，反应条件温和，易于操作。此外，本专利技术所述纳米基因载体由多肽和疏水性功能分子偶联构成两亲性结合物，该两亲性结合物的自组装过程中不生成共价健，没有逆反应，可形成高度有序的纳米结构，特别适合于构建生物医用材料。附图说明图1为PNP/DNA/抗体复合物粒径(A)及Zeta电位的影响(B)。其中，PNP代表纳米基因载体，PNP/DNA代表纳米基因载体/DNA复合物，PNP/DNA/抗体代表纳米基因载体/DNA/抗体复合物。图2为PNP/DNA/抗体复合物电镜形貌。图3为PNP/siRNA/抗体复合物的琼脂糖凝胶电泳阻滞实验结果。图4为PNP/siRNA/抗体复合物细胞毒性实验结果。图5为PNP/siRNA/抗体复合物体外转染siRNA细胞摄取实验结果。图6为蛋白免疫印记分析PNP/siRNA/抗体复合物的体外基因敲击效率。图7为正负电荷比(N:P)对转染效率的影响。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本专利技术的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本专利技术的宗旨和精神的情况下，可以对本专利技术进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1两亲性结合物的制备利用二氯三苯甲基氯树脂(购自本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具备肿瘤靶向作用的多肽纳米基因载体复合物，其特征在于，其由带正电荷的纳米基因载体、基因药物和具备肿瘤靶向的抗体构成；所述纳米基因载体上吸附有基因药物和具备肿瘤靶向的抗体；所述纳米基因载体由多肽和疏水性功能分子偶联构成。

【技术特征摘要】
1.一种具备肿瘤靶向作用的多肽纳米基因载体复合物，其特征在于，其由带正电荷的纳米基因载体、基因药物和具备肿瘤靶向的抗体构成；所述纳米基因载体上吸附有基因药物和具备肿瘤靶向的抗体；所述纳米基因载体由多肽和疏水性功能分子偶联构成。2.根据权利要求1所述的多肽纳米基因载体复合物，其特征在于，多肽与基因药物的正负电荷比为20:1～50:1。3.根据权利要求1或2所述的多肽纳米基因载体复合物，其特征在于，所述基因药物为siRNA和/或DNA。4.根据权利要求3所述的多肽纳米基因载体复合物，其特征在于，所述多肽为分子量在1.5kDa～4kDa之间两亲性穿膜肽，优选为多聚精氨酸；所述疏水性功能分子为胆固醇。5.根据权利要求4所述的多肽纳米基因载体复合物，其特征在于，多肽与抗体的质量比为10:1-5:1。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：赵颖，聂广军，郎佳妍，季天骄，丁艳萍，
申请(专利权)人：国家纳米科学中心，
类型：发明
国别省市：北京,11