构建的鲤凋亡基因、载体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种鲤凋亡基因、载体及其应用。所构建的鲤凋亡基因，从5’至3’依次由鲤MT‑1启动子、鲤Caspase‑8小亚基(P10)编码序列、鲤Caspase‑8大亚基(P20)编码序列、鲤MT‑1polyA信号序列组成。本发明专利技术的所述鲤DNA疫苗载体，包括真核表达载体及插入在所述真核表达载体中的上述鲤基因的凋亡基因。本发明专利技术以鲤的MT启动子和Caspase‑8为基础，构建诱导型凋亡基因，将其插入pEGFP‑N1载体构建“自杀性”DNA疫苗载体，该凋亡基因可以响应金属离子(例如Zn2+)等条件的诱导，表达Caspase‑8诱导转染细胞的凋亡，可应用于鲤DNA疫苗的制备，以进一步提高DNA疫苗的安全性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体是涉及构建的鲤凋亡基因、载体及其应用。
技术介绍
DNA疫苗自问世以来，就以其制备、运输、存贮简单并且能同时诱导体液免疫与细胞免疫等优点成为新型疫苗研究的重要方向。但是DNA疫苗接种后持续表达，可能诱导宿主自身免疫反应和免疫耐受，并且增加了疫苗DNA整合到宿主基因组的风险。尽管以甲病毒复制子为基础的“自杀性”DNA疫苗极大缩短了疫苗DNA在机体内的存在时间，但是此类疫苗载体也存在一些缺点：(1)甲病毒复制子片段过大(>7kb)，加上质粒复制及筛选、报告基因等必要元件，疫苗载体超过11kb，影响了载体容量，并且由于插入外源基因后的DNA疫苗过大，也增加了疫苗的构建难度，并且影响了转染效率。(2)凋亡进程无法控制，在接种“自杀性”DNA疫苗后2～5天后，疫苗即被清除，如果能延迟凋亡进程，则有可能获得更好的免疫效果。“自杀性”IHNV DNA疫苗的研究为新型疫苗载体构建提供了有益的启示。IHNV是一种严重危害虹鳟(Oncorhynchus mykiss)等鱼类的病毒，该病毒编码6个蛋白，其中囊膜G蛋白可以诱导产生中和抗体，也是目前商品化IHNV DNA疫苗的靶分子(IHNV DNA疫苗已于2005年7月在加拿大获准上市)；基质蛋白M(matrix protein,M)是IHNV的主要结构蛋白之一，作为主要毒力因子，可以诱导病毒感染后的细胞凋亡。Alonso等将M蛋白基因与虹鳟金属硫蛋白酶基因(metallothionein，MT)的启动子(pMT)结合，构建pMT-M凋亡元件，将其插入含有IHNV G蛋白基因的DNA疫苗中，构建了“自杀性”DNA疫苗。 该疫苗可以在金属离子(例如Zn2+)诱导下表达M蛋白，进而诱导细胞凋亡，清除了疫苗DNA。目前，鲤的DNA疫苗载体采用的是普通真核表达载体，例如pIRES-neo等，这些质粒一般包含了在大肠杆菌中的的复制起点(ori)，抗性筛选标记(例如，氨苄霉素抗性基因、新霉素抗性基因)，以及真核细胞中的启动子(例如，pCMV启动子)等结构。接种后外源基因持续表达，可能诱导宿主自身免疫反应和免疫耐受，并且增加了疫苗DNA整合到宿主基因组的风险。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的之一是提供一种构建的鲤的凋亡基因。实现上述目的的技术方案如下。一种构建的鲤凋亡基因，从5’至3’依次由鲤金属硫蛋白酶基因1(MT-1)启动子、鲤Caspase-8小亚基(P10)编码序列、鲤Caspase-8大亚基(P20)编码序列、鲤MT-1polyA信号序列组成。在其中一个实施例中，所述鲤的凋亡基因，其碱基序列为如SEQ ID No.19所示，或其碱基序列为为SEQ ID No.19的同义突变序列。本专利技术的另一目的是提供一种DNA疫苗载体，该DNA疫苗载体，在鲤体内可以响应Zn2+的诱导，诱导细胞凋亡，进而清除疫苗载体。实现上述目的的技术方案如下。一种鲤DNA疫苗载体，包括真核表达载体及插入在所述真核表达载体中的上述构建的鲤凋亡基因。在其中一个实施例中，所述真核表达载体为pEGFP-N1。本专利技术的另一目的是提供一种DNA疫苗载体的构建方法。实现上述目的的技术方案如下。一种鲤DNA疫苗载体的构建方法，包括以下步骤：(1)以鲤的组织DNA为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2引物，克隆MT-1全基因，并构建MT-1质粒；(2)以鲤的cDNA为模板，以SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4引物，克隆Caspase-8 CDS，并构建Caspase-8质粒；(3)以MT-1质粒、Caspase-8质粒为模板，分别以SEQ ID NO.1、和SEQ ID NO.5为引物，克隆MT-1的启动子序列；以SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7为引物进行扩增，克隆Caspase-8小亚基编码序列；以SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9为引物进行扩增，克隆Caspase-8大亚基编码序列；以SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.2为引物进行扩增，克隆MT polyA信号序列；上述扩增产物经PCR纯化后，等量加入PCR反应体系中，不加引物进行扩增，得总的扩增产物；(4)采用SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12为引物，步骤(3)中的总的扩增产物为模板，扩增全长的融合片段；(5)通过酶切，将纯化的步骤(4)所述的全长的融合片段插入到真核表达载体中，构建得到鲤DNA疫苗载体。本专利技术的另一个目的是提供上述构建的鲤凋亡基因或的鲤DNA疫苗载体应用。具体技术方案如下。上述构建的鲤凋亡基因在制备鲤DNA疫苗中的应用。上述鲤DNA疫苗载体在制备鲤DNA疫苗中的应用。本专利技术以鲤的MT启动子和Caspase-8(含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶8)为基础，构建诱导型凋亡基因，将其插入pEGFP-N1载体构建“自杀性”DNA 疫苗载体，该凋亡元件可以响应金属离子(例如Zn2+)等条件的诱导，表达Caspase-8诱导转染细胞的凋亡，以进一步提高DNA疫苗的安全性。附图说明图1为“自杀性”DNA疫苗载体的构建示意图；图2为凋亡基因构成片段的PCR扩增结果示意图，其中，M：DNA分子量标准；1：MT-1启动子；2：Caspase-8小亚基编码序列；3：Caspase-8大亚基编码序列。4：MT-1polyA signal。图3为凋亡基因的重叠PCR扩增结果示意图，M:DNAmarker；1：MT-1promoter、Caspase-8小亚基编码序列、Caspase-8大亚基编码序列、MT-1polyA signal的融合片段。图4为凋亡基因的核苷酸序列。图5为“自杀性”载体诱导的NGF-2细胞凋亡结果示意图。图6为载体免疫后的组织分布结果示意图，载体拷贝数值为106个宿主细胞中的检测值。图7为Zn2+诱导20天后的载体拷贝数检测结果示意图，载体拷贝数值为106个宿主细胞中的检测值。图8为Zn2+诱导20天后凋亡基因的PCR扩增结果示意图，其中M：DNA分子量标准；1～5：Zn2+诱导的锦鲤；6～10：未诱导的锦鲤；+：阳性对照(pEGFP-N1-MTCAS8作为模板)；－：阴性对照(ddH2O作为模板)。具体实施方式下面结合具体实施方式和附图对本专利技术作进一步详细说明，但本专利技术的实施方式不限于此。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。本专利技术在其中一个方面，克隆了鲤的金属硫蛋白酶基因1(MT-1)以及Caspase-8的完整编码序列(complete CDS)，构建了诱导型凋亡基因，该基因包含：鲤MT-1启动子、鲤Caspase-8小亚基(P10)编码序列、鲤Caspase-8大亚基(P20)编码序列、鲤MT-1polyA信号序列。将该凋亡基因插入pEGFP-N1质粒，构建了“自杀性”DNA疫苗载体。本专利技术在另一个方面，通过体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建的鲤凋亡基因，其特征在于，从5’至3’依次由鲤金属硫蛋白酶基因1启动子、鲤Caspase‑8小亚基编码序列、鲤Caspase‑8大亚基编码序列、鲤MT‑1 polyA信号序列组成。

【技术特征摘要】
2015.05.29 CN 20151029002011.一种构建的鲤凋亡基因，其特征在于，从5’至3’依次由鲤金属硫蛋白酶基因1启动子、鲤Caspase-8小亚基编码序列、鲤Caspase-8大亚基编码序列、鲤MT-1 polyA信号序列组成。2.根据权利要求1所述鲤凋亡基因，其特征在于，其碱基序列为如SEQ ID No.19所示，或其碱基序列为为SEQ ID No.19的同义突变序列。3.一种鲤DNA疫苗载体，其特征在于，包括真核表达载体及插入在所述真核表达载体中的权利要求1或2所述的鲤凋亡基因。4.根据权利要求3所述的鲤DNA疫苗载体，其特征在于，所述真核表达载体为pEGFP-N1。5.鲤DNA疫苗载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以鲤的组织DNA为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2引物，克隆MT-1全基因，并构建MT-1质粒；(2)以鲤的cDNA为模板，以SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4引物，克隆Caspase-8 CDS，并构建Caspase-8质粒；(3)以MT-1质粒、Caspase-8质粒为模板，分别以SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘振兴，柯浩，郝乐，马江耀，马艳平，梁志凌，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物卫生研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44