本发明专利技术公开了一种基因片段，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明专利技术还提供了一种载体pPlasmid‑Clearance，所述载体pPlasmid‑Clearance是通过同源重组的方法，在接合转移载体pEF01的抗性基因区域插入核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段构建而成，所述接合转移载体pEF01的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。该基因片段和载体pPlasmid‑Clearance可以逆转环境及动物内菌群中多粘菌素耐药基因mcr‑1耐药菌的耐药性，阻断多粘菌素耐药基因mcr‑1的传播，在细菌性疾病的预防和临床治疗上具有极大的应用潜力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种基因片段、载体pPlasmid-Clearance及应用。
技术介绍
耐药菌的广泛传播，严重威胁了人类和动物的健康。细菌的耐药性根据其产生原因可分为两种形式：一是天然耐药性又称固有耐药性，是由细菌染色体上的耐药相关基因决定、在细菌世代间垂直传递，又称天然耐药性；二是获得性耐药，这种耐药性主要由后天获得，是随着抗菌药物的长期大量使用，由含有耐药基因的质粒通过接合反应在细菌间水平传递耐药基因，介导接受质粒的受体菌产生耐药蛋白，对抗生素由原先的敏感转为耐受状态。通过质粒介导的获得性耐药可因不再接触抗生素而消失，也可由质粒将耐药基因转移至染色体世代相传，成为固有性耐药。细菌中耐药基因的传播主要通过转化、转导、接合等方式，其中由耐药质粒介导的细菌接合转移是最易发生的传递方式，且不同来源的细菌可以通过质粒的介导而获得相同的耐药谱，造成抗生素在临床上的疗效降低甚至无效。耐药质粒介导的耐药与染色体突变导致的耐药不同，耐药质粒可以通过水平基因传递进行扩散；质粒介导的耐药性常为多重耐药，可以使宿主菌耐受多种抗生素的作用，耐药质粒上携带的耐药基因赋予了细菌对抗生素的耐药性，消除细菌的耐药质粒，细菌的药性也会随之丧失。耐药质粒一旦被消除，细菌的耐药性则不可恢复，除非外源耐药质粒再次转入。多粘菌素耐药基因mcr-1是在近年来在大肠杆菌中发现，该基因位于宿主菌的质粒pHNSHP45上，质粒携带的mcr-1基因所介导抗粘菌素耐药细菌的广泛分布，由于该基因存在于质粒上，使得这种耐药性在大量细菌菌种之间蔓延。一旦这种具备耐药性的细菌迅速蔓延，全球将笼罩在无法治愈的感染病阴影中。当前国内外对耐药质粒消除的研发仍处于起步阶段，所研究的产品均存在某些不足，如化学消除剂对人体有害或方法本身不适用于人体；中药消除剂有效成分不确定，作用机理不明确，消除效果不稳定。目前仍没有一个较好的可供体内使用的消除含有多粘菌素耐药基因mcr-1的质粒的载体。因此，有必要开发一种用于临床的消除含有多粘菌素耐药基因mcr-1的质粒的载体。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基因片段、载体pPlasmid-Clearance及应用，该载体能够应用于临床上含多粘菌素耐药基因mcr-1的质粒的消除，机理明确、效果稳定，且不会对人体造成伤害。本专利技术提供了一种基因片段，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本专利技术还提供了一种载体pPlasmid-Clearance，所述载体pPlasmid-Clearance是通过同源重组的方法，在接合转移载体pEF01的抗性基因区域插入核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段构建而成，所述接合转移载体pEF01的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本专利技术还提供了一种载体pPlasmid-Clearance的构建方法，具体按照以下步骤实施：步骤一，合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段；步骤二，制备接合转移载体pEF01，并将接合转移载体pEF01转化入大肠杆菌感受态细胞中，得到pEF01转化细胞；步骤三，制备pEF01转化细胞的感受态细胞，得到pEF01感受态细胞；步骤四，采用多片段一步法克隆试剂盒，将载体pKD46转化入pEF01感受态细胞中，得到pKD46转化细胞；步骤五，制备pKD46转化细胞的电转化感受态细胞，得到pKD46感受态细胞；步骤六，利用多片段一步法克隆试剂盒，将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段电转化到pKD46感受态细胞中，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段与接合转移载体pEF01发生重组反应，得到含有载体pPlasmid-Clearance的重组细胞；步骤七，提取阳性克隆细胞重组细胞中的载体pPlasmid-Clearance，即得到载体pPlasmid-Clearance。本专利技术还提供了上述载体pPlasmid-Clearance，在消除革兰氏阴性菌中含多粘菌素耐药基因mcr-1的质粒的临床应用。本专利技术还提供了上述载体pPlasmid-Clearance，在消除大肠杆菌中含多粘菌素耐药基因mcr-1的质粒的临床应用。本专利技术还提供了一种利用上述载体pPlasmid-Clearance，消除大肠杆菌中含多粘菌素耐药基因mcr-1的质粒的方法，具体包括以下步骤：步骤1，将载体pPlasmid-Clearance转化入大肠杆菌Nissle 1917菌株，得到载体pPlasmid-Clearance转化菌；步骤2，将载体pPlasmid-Clearance转化菌加入含氨苄的LB培养基中，37℃培养12-16h，离心并收集沉淀，用LB培养基清洗沉淀，并将清洗后的沉淀用LB培养基稀至OD600＝0.5，得到供体大肠杆菌溶液；步骤3，将pHNSHP45质粒转化入大肠杆菌中，得到受体大肠杆菌；步骤4，将受体大肠杆菌加入含多粘菌素B的LB培养基中，37℃培养12-16h，离心并收集沉淀，用LB培养基清洗沉淀，并将清洗后的沉淀用LB培养基稀至OD600＝0.5，得到受体大肠杆菌溶液；步骤5，将供体大肠杆菌溶液和受体大肠杆菌溶液按1:1的体积比例混合，之后于37℃100rpm培养8h，然后剧烈震荡终止反应，得到菌体混合液，完成含多粘菌素耐药基因mcr-1的质粒的消除；步骤6，结果判断：将菌体混合液涂到含有多粘菌素B的琼脂板上，观察琼脂板上单菌落是否具有多粘菌素B抗性；或者将菌体混合液涂到含有氨苄和多粘菌素B两种物质的琼脂板上，观察琼脂板上单菌落是否具有氨苄和多粘菌素B双抗性；若单菌落不具有多粘菌素B抗性或不具有者氨苄和多粘菌素B双抗性，则该单菌落中含多粘菌素耐药基因mcr-1的质粒被成功消除。优选的，上述消除大肠杆菌中含多粘菌素耐药基因mcr-1的质粒的方法中，步骤2和步骤4的离心条件均为4℃，3000rpm离心2min。本专利技术提供的基因片段和载体pPlasmid-Clearance，具有以下优点：1、可以通过同源重组置换sgRNA表达盒，使其打靶其它耐药基因或者同时打靶多种重要耐药基因，在临床耐药致病菌的治疗上，适合范围更广、更加有效且成本低，具有极大的应用潜力。2、可以用于消除环境及动物体内的耐药菌中的多粘菌素耐药基因mcr-1、阻断多粘菌素耐药基因mcr-1的传播，并且使耐药菌对多粘菌素耐药基因mcr-1侵入免疫，适用于逆转耐药质粒介导的耐药性，恢复其对廉价抗生素的敏感性，因此，本专利技术所构建的载体pPlasmid-Clearance可以逆转环境以及动物内菌群中多粘菌素耐药基因mcr-1耐药菌的耐药性，阻断耐药基因的传播，在细菌性疾病的预防和临床治疗上具有极大的应用潜力。3、相比于化学分子和中药质粒消除等质粒消除剂，本专利技术所构建的载体pPlasmid-Clearance作用机制明确，通过天然的细菌接合反应转移至受体菌中，直接切割含有耐药基因的质粒或受体菌染色体DNA，消除耐药质粒，逆转受体菌耐药性，或者是消除含有耐药基因的受体菌，可以用于动物体内耐药基因的消除或者环境中耐药基因的消除，在应用上具有高度的生物安全性。附图说明图1是本专利技术的基因片段的结构示意图；图2是本专利技术的载体pPlasmid-Clearance本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基因片段，其特征在于，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种基因片段，其特征在于，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种载体pPlasmid-Clearance，其特征在于，所述载体pPlasmid-Clearance是通过同源重组的方法，在接合转移载体pEF01的抗性基因区域插入核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段构建而成，所述接合转移载体pEF01的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求2所述的载体pPlasmid-Clearance的构建方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：步骤一，合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段；步骤二，制备接合转移载体pEF01，并将接合转移载体pEF01转化入大肠杆菌感受态细胞中，得到pEF01转化细胞；步骤三，制备pEF01转化细胞的感受态细胞，得到pEF01感受态细胞；步骤四，采用多片段一步法克隆试剂盒，将载体pKD46转化入pEF01感受态细胞中，得到pKD46转化细胞；步骤五，制备pKD46转化细胞的电转化感受态细胞，得到pKD46感受态细胞；步骤六，利用多片段一步法克隆试剂盒，将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段电转化到pKD46感受态细胞中，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段与接合转移载体pEF01发生重组反应，得到含有载体pPlasmid-Clearance的重组细胞；步骤七，提取重组细胞中的载体pPlasmid-Clearance，即得到载体pPlasmid-Clearance。4.根据权利要求2所述的载体pPlasmid-Clearance，在消除革兰氏阴性菌中含多粘菌素耐药基因mcr-1的质粒的临床应用。5.根据权利要求2所述的载体pPlasmid-Clearance，在消除...
【专利技术属性】
技术研发人员：王铁东，王大成，向华，董海司，母丹，明迪，王琳，邓旭明，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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