RNAi干扰片段、干扰载体、制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种用于干扰动物睾丸生精细胞中Zfx基因的RNAi干扰片段及RNAi干扰载体。RNAi干扰载体具有所述RNAi干扰片段，所述RNAi干扰片段包含下列序列：TGAGG CAGAT GTATC TGAAA TTCAA GAGATTTCAG ATACA TCTGC CTCTT TTTTC或TGCAG AGAAG GCCATTGAAT TTCAA GAGAA TTCAA TGGCC TTCTC TGCTT TTTTC。本发明专利技术提供的RNAi干扰片段及RNAi干扰载体通过对猪睾丸细胞中Zfx基因进行干扰，使得Zfx基因表达下降，间接影响X精子的受精能力，从而达到控制猪后代性别的目的。

【技术实现步骤摘要】
RNAi干扰片段、干扰载体、制备方法及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种用于控制动物性别的RNAi干扰片段、RNAi干扰载体、及RNAi干扰载体的制备方法及其应用。
技术介绍
动物性别控制的目的在于在动物出生前即通过人工方法控制其性别。实现动物的性别控制，有重要意义，主要体现在：(1)能及时淘汰或终止不需要性别的动物,提高畜牧业生产效益(奶牛、奶山羊、蛋鸡雌性后代价值高，雄性价值低；肉牛、肉猪、肉鸡雄性生长速度快)；(2)在转基因动物生产中，提高所需性别动物的利用价值(雌性动物利用价值高，雄性动物利用价值低)；(3)通过增加希望的性别动物的比例，提高育种强度；(4)避免胚胎移植异性胚胎导致的孪生不育等。对动物性别控制的相关研究早在多年前就已经开始。目前国内外动物进行性别控制的方法主要有三种：(1)X精子与Y精子的分离，即通过X、Y精子微弱的生物学差异，分离出含两种不同染色体的精子。主要采用物理分离法，如采用流式细胞分离仪分离精子的准确率可达到90％。(2)胚胎的性别鉴定，即通过鉴定胚胎的性别，从而影响出生的性别比例。早期胚胎性别鉴定方法主要有细胞学方法、免疫性方法、分子生物学方法、雄性特异性DNA探针法等。(3)控制动物受精的外部环境，动物受精时外部环境中的某些因素也是性别决定机制的重要条件，主要包括营养、温度、体液酸碱度、输精时间、年龄胎次、激素水平等。但这些方法都存在一些缺点，限制了实际的应用。例如，X、Y精子分离的速度太慢，精液价格昂贵且不耐冷冻，致使后代畸形率较高。进行胚胎性别鉴定时，从胚胎上切取部分细胞，而后经冷冻、解冻会对胚胎造成一定的损害，使胚胎移植的成功率下降，同时劣质胚胎的性别鉴定成功率更低，制约了提供预知性别动物胚胎的商业化进程。在控制动物受精的外部环境中，由于影响动物性别决定机制的外部环境有很多因素，调控单一因素无法有效影响性别，同时调控多种因素在实际中很难达到多种因素的最佳状态，且调控这些因素的效果还与动物的体质有关，因此控制性别的效果不甚明显。如今，随着科学技术水平的发展，从基因水平着手对性别控制进行研究已经成为一种新的方向，同时随着基因技术的日趋成熟，基因技术的成本将大幅下降，使其在生产应用中大规模推广成为了一种可能。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术实施例提供一种RNAi干扰片段、干扰载体、制备方法及应用。主要目的是通过RNAi干扰载体对动物X染色体上的Zfx基因进行干扰，使得Zfx基因表达下降，以此达到人为控制动物性别的目的。为达到上述目的，本专利技术主要提供如下技术方案：一方面，本专利技术实施例提供了一种RNAi干扰片段，用于干扰动物X染色体上的Zfx基因，所述RNAi干扰片段包含下列任一序列：TGAGGCAGATGTATCTGAAATTCAAGAGATTTCAGATACATCTGCCTCTTTTTTC或TGCAGAGAAGGCCATTGAATTTCAAGAGAATTCAATGGCCTTCTCTGCTTTTTTC；所述Zfx基因负责编码一个大的酸性链锌指蛋白上12-13个转录因子，具有特定的核定位信号区域和DNA结合位点，能够特异性地与靶基因结合，定向引导靶基因穿过核膜，定位于精子细胞核内，其编码的蛋白作为转录调控因子，与X精子的发育相关。进一步地，所述RNAi干扰片段作为制备控制动物性别的药物、试剂盒的应用。本专利技术实施例还提供一种RNAi干扰载体，用于干扰动物X染色体上的Zfx基因，所述RNAi干扰载体具有RNAi干扰片段；所述RNAi干扰片段包含有以下序列：TGAGGCAGATGTATCTGAAATTCAAGAGATTTCAGATACATCTGCCTCTTTTTTC或TGCAGAGAAGGCCATTGAATTTCAAGAGAATTCAATGGCCTTCTCTGCTTTTTTC。进一步地，所述RNAi干扰载体包括pLentiLox3.7载体，所述pLentiLox3.7载体与所述RNAi干扰片段连接。进一步地，所述RNAi干扰载体在动物受精前进行性别控制中应用。进一步地，所述RNAi干扰载体以睾丸直接注射的方式注射至动物体内，用于干扰动物X染色体上的Zfx基因。另一方面，本专利技术实施例还提供一种RNAi干扰载体的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：酶切所述pLentiLox3.7载体；将所述RNAi干扰片段与酶切后的所述pLentiLox3.7载体连接，得到连接产物；其中，所述RNAi干扰片段包含以下序列：TGAGGCAGATGTATCTGAAATTCAAGAGATTTCAGATACATCTGCCTCTTTTTTC或TGCAGAGAAGGCCATTGAATTTCAAGAGAATTCAATGGCCTTCTCTGCTTTTTTC；将所述连接产物转化至感受态细胞中，并筛选出阳性克隆菌液；对阳性克隆菌液进行测序鉴定，并将测序结果与所述RNAi干扰片段序列完全一致的菌液进行扩增；从所述扩增的菌液中提取RNAi干扰载体。进一步地，所述的将所述连接产物转化至感受态细胞中，并筛选出阳性克隆菌液，具体为：将所述连接产物转化至感受态细胞中，并采用氨苄(AMP+)抗性筛选和蓝白斑筛选，筛选出阳性克隆菌液。进一步地，所述的从所述扩增的菌液中提取RNAi干扰载体，具体为：采用质粒提取试剂盒进行提取或采用SDS碱裂解法进行提取。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点：本专利技术实施例提供的RNAi干扰片段以及RNAi干扰载体可以对动物X染色体上的Zfx基因进行干扰，使得Zfx基因表达下降，间接影响X染色体的发育，以此达到人为控制动物性别的目的。另外，本专利技术实施例以睾丸直接注射的方式注射至动物睾丸，不会对动物的健康和睾丸功能产生影响，而且操作方便、快捷，成本低廉。附图说明图1示出了pLentiLox3.7载体的结构示意图；图2示出了两种干扰载体的干扰组和对照组中仔猪睾丸生精细胞Zfx基因的mRNA表达量的示意图；图3示出了干扰片段和pLentiLox3.7载体连接形成干扰载体的示意图。具体实施方式为更进一步阐述本专利技术为达成预定专利技术目的所采用的技术手段及功效，结合较佳实施例详细说明如下。实施例1设计并合成用于干扰动物睾丸生精细胞中的Zfx基因的RNAi干扰片段。下面本实施例以猪睾丸生精细胞中的Zfx基因的RNAi干扰片段为例，对本专利技术提供的技术方案进行说明。具体如下：根据猪Zfx基因的mRNA序列(GenBank:KF803247)设计并筛选出两个siRNA片段，然后按照所述pLentiLox3.7载体及所带启动子的要求，在两个siRNA片段序列两端添加酶切位点、loop环及终止序列，最终形式为胸腺嘧啶(T)+正义链19nt靶序列+茎环结构(TTCAAGAGA)+靶序列反向互补序列+RNAPolyIII聚合酶转录终止位点(TTTTTT)+XhoI酶切位点(GAGCT)，合成两对shRNAi的寡聚核苷酸序列。该两对shRNAi干扰片段分别为shRNA1和shRNA2，如表1所示。表1本实施例中的shRNA干扰片段的设计原则为：常规shRNA的设计原则是以成熟的mRNA为标准，目前设计的shRNA二聚体的双链有以不对称双链作为干扰片段的，但是基本以21nt的对称双链为主。设计时3’突出末端最好为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种RNAi干扰片段，用于干扰动物X染色体上的Zfx基因，其特征在于，所述RNAi干扰片段包含下列任一序列：TGAGG CAGAT GTATCTGAAA TTCAA GAGAT TTCAG ATACA TCTGC CTCTT TTTTC或TGCAG AGAAG GCCAT TGAAT TTCAA GAGAA TTCAA TGGCC TTCTCTGCTT TTTTC；所述Zfx基因负责编码一个大的酸性链锌指蛋白上12‑13个转录因子，具有特定的核定位信号区域和DNA结合位点，能够特异性的与靶基因结合，定向引导靶基因穿过核膜，定位于精子细胞核内，其编码的蛋白作为转录调控因子，与X精子的发育相关。

【技术特征摘要】
1.一种RNAi干扰片段，用于干扰猪X染色体上的Zfx基因，其特征在于，所述RNAi干扰片段为下列任一序列：TGAGGCAGATGTATCTGAAATTCAAGAGATTTCAGATACATCTGCCTCTTTTTTC或TGCAGAGAAGGCCATTGAATTTCAAGAGAATTCAATGGCCTTCTCTGCTTTTTTC；所述Zfx基因负责编码一个大的酸性链锌指蛋白上12-13个转录因子，具有特定的核定位信号区域和DNA结合位点，能够特异性的与靶基因结合，定向引导靶基因穿过核膜，定位于精子细胞核内，其编码的蛋白作为转录调控因子，与X精子的发育相关。2.权利要求1所述的RNAi干扰片段作为制备控制猪性别的药物、试剂盒的应用。3.一种RNAi干扰载体，用于干扰猪X染色体上的Zfx基因，其特征在于，所述RNAi干扰载体具有RNAi干扰片段；所述RNAi干扰片段为以下序列：TGAGGCAGATGTATCTGAAATTCAAGAGATTTCAGATACATCTGCCTCTTTTTTC或TGCAGAGAAGGCCATTGAATTTCAAGAGAATTCAATGGCCTTCTCTGCTTTTTTC。4.根据权利要求3所述的RNAi干扰载体，其特征在于，所述RNAi干扰载体包括pLentiLox3.7载体，所述pLentiLox3.7载体与所述RNAi干扰片段连接。5.一种RNAi干扰载体的应用，其特征在于，根据权利要求4所述的RNAi干扰载体，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾斌，宁孟影，程波，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：新疆;65