基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白及制备方法，方法包括在Gluc荧光素酶基因的C端引入SEP‑tag，将连接有SEP标签的Gluc荧光素酶基因插入表达载体的多克隆位点，得到荧光素酶Gluc‑SEP基因表达载体，将该表达载体转化到同时具有trxB

【技术实现步骤摘要】
基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白及制备方法
本专利技术涉及蛋白制备
，尤其是涉及一种基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白及制备方法。
技术介绍
医学影像技术是探究体内细微生命的重要方法，它可实现分子水平上高靶向地对活体内疾病的发生、生长进行治疗，是一种新的健康医疗模式。医学影像技术主要包括核磁共振MRI、CT、医学超声以及光学成像等。生物发光成像(Bioluminescenceimaging)是光学成像中的一种重要的成像手段，它具有无需光源激发，无散射、穿透率高、极低的背景干扰和极高信噪比等优点。其在有氧的条件下，以荧光素酶作为体内报告源，通过与底物作用而发光。近年来已被广泛应用于生命科学、医学研究及药物研发等领域。作为报告基因，荧光素酶需要具备某些特定的条件，如具有明显的光谱特征，高量子产率且底物在细胞内无累积等。Gaussialuciferase(Gluc)是从夏威夷的一种海洋桡足类动物中获取的荧光素酶，它具有2个独特的domain区域，且都有生物发光活性，由185个氨基酸组成，大小19.9KDa且以肠腔素作为底物。因其超高的荧光强度，良好的酶稳定性和分泌活性，被广泛用于开发生物发光成像检测系统对基因分子事件、蛋白质相互作用、细胞生命活动、动物生理病理等生物学过程实时监控。而且，Gluc中含有11个半胱氨酸，占氨基酸数量的5.95％，研究更显示，Gluc中的10个半胱氨酸通过共价键可以形成5对二硫键，其中一对二硫键处于2个domain区域之间，而其他二硫键都在domain区域内部中形成，因此，Gluc也被称之为二硫键蛋白(Disulfidebondedprotein)。Gluc作为一种二硫键蛋白，其面临的最大困难是如何在大肠杆菌表达中形成可溶并完全正确折叠的二硫键蛋白，因为二硫键的正确折叠对于蛋白质的稳定性，活性等具有至关重要的影响。而大肠杆菌中蛋白的高效表达往往难以预期，特别是对于Gluc这样一种高度含有二硫键的蛋白质，更是不可控。因此，Gluc荧光素酶在应用中也存在一些局限性，主要包括信号猝灭，在体外吸收蓝光会迅速光衰减等，这使其应用遇到了极大的瓶颈。因此，如何优化其光学稳定性，建立对个体的长时间、可重复性、可稳定控制的跟踪成像体系是亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白的制备方法，该方法解决了荧光素酶光学稳定性差，荧光猝灭迅速的问题，还解决了由于Gluc荧光素酶含有多组二硫键导致其在大肠杆菌中表达时，难以实现可溶性和二硫键的正确折叠从而使其在实际生物发光成像应用中受到限制的问题。本专利技术的另一个目的在于提供由上述制备方法制得的基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白，该二硫键蛋白具有高的光稳定性。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白的制备方法，该方法包括在Gluc荧光素酶基因的C端引入SEP-tag，将连接有SEP标签的Gluc荧光素酶基因插入表达载体的多克隆位点，得到荧光素酶Gluc-SEP基因表达载体，将该表达载体转化到同时具有trxB-/gor-抗性基因和DsbC氧化还原基因的大肠杆菌菌株，得到含有该表达载体的表达菌株，培养该表达菌株，表达得到基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白。优选地，所述方法还包括在连接有SEP标签的Gluc荧光素酶基因的N端引入纯化标签。优选地，，所述表达载体为pET系列表达载体，所述pET系列表达载体包括pET28a、pET21a、pET25b、pET27b或pET30a。优选地，所述纯化标签包括His6、GST、Strep或CBD。优选地，所述多克隆位点为BamHI和SalI酶切位点、BamHI和HindIII酶切位点、BamHI和NotI酶切位点、BamHI和XhoI酶切位点、NdeI和SalI酶切位点、NdeI和HindIII酶切位点、NdeI和NotI酶切位点或NdeI和XhoI酶切位点。优选地，所述同时具有trxB-/gor-抗性基因和DsbC氧化还原基因的大肠杆菌菌株包括SHuffleT7BE.coli菌株或SHuffleT7K12E.coli菌株。优选地，所述方法中用IPTG诱导连接有SEP标签的Gluc荧光素酶基因的表达，其中，IPTG的浓度为1mmol/L，诱导温度为35-37℃，诱导时间为5-8h；或诱导温度为14-18℃，诱导时间为10-14h。优选地，所述方法中还包括将得到的基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白进行纯化的步骤。由所述制备方法制得的基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白的二级结构具有大于80％的α-螺旋结构。优选地，所述二硫键蛋白具有下述一种或几种特性：光谱最高发射峰为480nm，或光衰减的半衰期为6min，或在60℃孵育30min后活性保持在85％以上，或从25℃到95℃过程中，二级结构组成没有变化。本专利技术的有益效果如下：本专利技术在Gluc的C端引入一个SEP-tag(GDDD–GDDDGDDD)促进了大部分的二硫键的正确折叠，将C端带有SEP-tag的Gluc基因转入到同时具有trxB-/gor-抗性基因和DsbC氧化还原基因的大肠杆菌菌株中，有效减少了因大肠杆菌在表达过程中逐渐形成的缺氧环境而使二硫键正确折叠的氧化环境缺失的问题，构建的表达菌株进行蛋白表达后，得到的蛋白荧光活性非常强，并且圆二色谱CD热力学研究显示其二级结构的热稳定非常好，从常温到95℃的高温，其二级结构没有发生任何改变。附图说明图1为实施例3和对比例1的荧光光谱发射峰的比较图；图2实施例3和对比例1的荧光活性比较图；图3为实施例3和对比例1的荧光活性衰减动力学的比较图；图4为实施例3和对比例1的热稳定性比较图；图5为实施例3和对比例1的圆二色谱峰比较图；图6A为对比例1的圆二色谱热力学稳定性图；图6B为实施例3的圆二色谱热力学稳定性图。具体实施方式下面将结合附图对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术的专利技术人通过对Gluc荧光素酶结构的理性分析，得出大肠杆菌中表达的Gluc荧光素酶之所以稳定性差，光信号衰减快，主要有两方面的原因：1.Gluc作为一种二硫键蛋白，难以在大肠杆菌表达中形成可溶并完全正确折叠的二硫键蛋白；2.如何提供二硫键正确折叠所需要的氧化环境；而传统的提高Gluc荧光素酶稳定性和荧光强度的策略主要是通过构建随机突变体文库，从中筛选优势性能的Gluc荧光素酶突变体，工作量大，比较繁琐并且盲目性较大。所以，本专利技术的专利技术人基于对Gluc荧光素酶结构的理性分析，通过在Gluc的C端引入一个SEP-tag(GDDD–GDDD–GDDD)；然后选择同时具有trxB-/gor-抗性基因和DsbC氧化还原基因的大肠杆菌菌株提供二硫键正确折叠所需要的氧化环境而解决了上述问题。本专利技术的上述方法构思也适用于其他二硫键蛋白，如vtPAN-HIS、AppA、Cel9A、PhoA、Chitinase和CelZ等。实施例1荧光素酶Gluc-SEP基因表达载体的构建1.引物正向引物：5’-CGCGGATCCAT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包括在Gluc荧光素酶基因的C端引入SEP‑tag，将连接有SEP标签的Gluc荧光素酶基因插入表达载体的多克隆位点，得到荧光素酶Gluc‑SEP基因表达载体，将该荧光素酶Gluc‑SEP基因表达载体转化到同时具有trxB

【技术特征摘要】
1.一种基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包括在Gluc荧光素酶基因的C端引入SEP-tag，将连接有SEP标签的Gluc荧光素酶基因插入表达载体的多克隆位点，得到荧光素酶Gluc-SEP基因表达载体，将该荧光素酶Gluc-SEP基因表达载体转化到同时具有trxB-/gor-抗性基因和DsbC氧化还原基因的大肠杆菌菌株，得到含有该荧光素酶Gluc-SEP基因表达载体的重组表达菌株，培养该重组表达菌株，表达得到基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括在连接有SEP标签的Gluc荧光素酶基因的N端引入纯化标签。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述纯化标签包括His6、GST、Strep或CBD。4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体为pET系列表达载体，所述pET系列表达载体包括pET28a、pET21a、pET25b、pET27b或pET30a。5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述多克隆位点为BamHI和SalI酶切位点、BamHI和HindIII酶切位点、BamHI和NotI酶切位点、BamHI和XhoI酶切位点、NdeI和SalI酶切位点、Nd...

【专利技术属性】
技术研发人员：金宗文，袁静，罗擎颖，杨偲，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44