本发明专利技术公开了鸭瘟病毒gE基因转移载体pUC-ΔgE-EGFP，包含转移载体pUC-ΔgE-EGFP的大肠杆菌种(Escherichia?coli)JM109于2012年2月24日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC?M2012033；分类命名为大肠杆菌JM109/pUC-ΔgE-EGFP(Escherichia?coli?JM109/pUC-ΔgE-EGFP)。该转移载体可通过与鸭瘟病毒同源重组，获得EGFP标记基因的重组鸭瘟病毒，鸭瘟病毒gE缺失重组株DPV-ΔgE-EGFP，于2012年2月23日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC?NO：V201210。该重组病毒将可以发展成为具有筛选标记的有效预防鸭瘟的新型疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及动物医学领域中一种基因工程制品的制备方法，特别涉及鸭瘟病毒gE基因部分缺失的转移载体构建及其应用。
技术介绍
鸭痕(duck plague,DP)是由疱疫病毒科中的鸭痕病毒(Duck plague virus,DPV)引起的常见于鸭、鹅、天鹅等雁形目水禽的一种高度致死性传染病。目前，鸭瘟仍是危害水禽养殖业持续稳定发展的重要因素，加强鸭瘟的研究对水禽养殖业的防制尤为重要。用于预防鸭瘟的疫苗主要有灭活苗和弱毒苗两大类，一般认为弱毒苗免疫效力较灭活苗好，弱毒苗虽然只使鸭体产生低水平中和抗体，当受强毒攻击时可使鸭体产生明显的血清记忆反应。基因缺失疫苗毒株稳定，不易返祖，免疫原性好、安全性高。gE基因是非常重要的毒力基因，它的缺失使病毒的毒力大大降低，但是病毒仍可以复制，因此在疱疹病毒基因工程疫苗中gE基因缺失疫苗的研究十分关键。另一方面，重组病毒活载体疫苗兼有常规活疫苗和灭活疫苗的优点，是当前新型疫苗研制与开发的主要方向。疱疹病毒是用于活载体疫苗制备的理想病毒载体之一，作为疱疹病毒成员的鸭瘟病毒，基因组较大，约160kb左右，可容纳多个外源基因的插入。以gE基因作为一个插入位点，来表达外源基因蛋白，由于gE基因的缺失、突变，从而使该鸭瘟病毒的野毒株毒力减弱，不再引起临床疾病，但仍能感染宿主并诱发保护性免疫力，而且和外源基因蛋白的共表达，可产生多联疫苗。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种鸭瘟病毒转移载体及其构建方法，该转移载体可通过与鸭瘟病毒同源重组，获得重组鸭瘟病毒，为鸭瘟病毒gE基因缺失疫苗及其gE基因功能研究打下基础。一种鸭瘟病毒gE基因转移载体pUC- Δ gE-EGFP,包含转移载体pUC_ Δ gE-EGFP的大肠杆菌种(Escherichia coli) JM109于2012年2月24日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO :M2012033 ;分类命名为大肠杆菌JM 109/pUC-ΔgE-EGFP(Escherichia coli JM109/pUC-ΔgE-EGFP)。所述的转移载体pUC- Δ gE-EGFP的制备方法，包括以下步骤I)以鸭瘟病毒CHv株为材料，利用PCR扩增部分gE基因及其左侧翼(L) 1073bp片段和部分gE基因及其右侧翼(R) 1130bp片段，克隆进载体pMD18-T，构建质粒pMD_L和PMD-R ；2)先将pMD-L用Hind III和BamH I酶切，回收1073bp片段，克隆进已用相应限制性内切酶酶切的PUC18载体，然后再将pMD-R中的部分gE基因及其右侧翼(R) 1130bp片段以BamH I和EcoR I插入到已含有部分gE基因及其左侧翼(L)的pUC_L载体中，获得载体 pUC-ΔgE ；3)用ApaL I和Mlu I酶切质粒pEGFP_Cl，回收包含CMV立即早期启动子、EGFP基因、转录终止信号SV40polyA以及一个多克隆位点基因共2016bp片段的EGFP表达盒，然后对其进行补平；4)先将载体pUC-AgE，用BamH I酶切后，进行补平，再将其与3)中获得补平后的EGFP表达盒连接，从而获得转移载体pUC- Δ gE-EGFP ；上述扩增PCR扩增部分gE基因及其左侧翼(L) 1073bp片段的上、下游引物分别是上游引物5'-AAGCTTCCTGAAAGATGTTCTAAG-3'下游引物5'-GGATCCTTGATGATAGTCTGCTATAC-3' 上述扩增PCR扩增部分gE基因及其右侧翼(R)1130bp片段的上、下游引物分别是上游引物5'-GGATCCGITTGTAGTCGGTCTCGG-3'下游引物5'-GAATTCCGTATTAACCTTTTGTAGCT-3'。鸭瘟病毒gE缺失重组株DPV-Λ gE-EGFP，于2012年2月23日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO :V201210。所述鸭瘟病毒gE缺失重组株DPV- Δ gE-EGFP的制备方法，由以下步骤完成I)鸭瘟病毒CHv株感染鸭胚成纤维细胞；2)转移载体pUC- Δ gE-EGFP质粒转染；3)收获出现荧光斑的细胞；4)结合无限稀释法，通过空斑纯化获得重组鸭瘟病毒。实验结果表明重组病毒和弱毒疫苗均能提供较好的保护，并且重组病毒表现出更优的免疫效果，可以进一步发展成为有效预防鸭瘟病的新型疫苗。附图说明图1鸭瘟病毒gE基因的跨膜区预测。结果表明gE蛋白有跨膜区域，是典型的I型膜蛋白。gE蛋白由396个氨基酸的胞外区、23个氨基酸的跨膜区和71个氨基酸的胞质区所组成。图2转移载体左右臂PCR扩增。M为DL2000，L指左臂片段，大小为1073bp ；R指右臂片段，大小为1130bp。图3包含CMV立即早期启动子、EGFP基因、转录终止信号SV40polyA以及一个多克隆位点基因共2016bp片段的EGFP表达盒片段。M为DL2000，G代表EGFP表达盒。图4转移载体pUC- Δ gE-EGFP结构示意图。图5感染重组病毒DPV- Δ gE-EGFP的鸭胚成纤维细胞呈现均一绿色荧光。图6常规PCR鉴定重组病毒DPV- Δ gE-EGFP的结果。M为DL15000，I为DPV-CHv亲本株扩增片段约1800bp，2为重组病毒DPV- Δ gE-EGFP的扩增片段约2700bp。图7A、B、C分别为鸭瘟病毒CHv亲本株在可见光显微镜下、荧光显微镜下及合成图片，D、E、F分别为重组病毒DPV- Δ gE-EGFP在可见光显微镜下、荧光显微镜下及合成图片。具体实施例方式以下结合具体实施例，对本专利技术进行详细说明。包含转移载体pUC-Λ gE-EGFP 的大肠杆菌种(Escherichia coli) JM109 于 2012年2月24日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO :M2012033 ;分类命名为大肠杆菌 JM109/pUC-Λ gE-EGFP (Escherichia coli JM 109/pUC-ΔgE-EGFP)。鸭瘟病毒gE缺失重组株(DPV- Δ gE-EGFP)已于2012年2月23日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO :V201210。 I病毒毒株和细胞鸭瘟病毒强毒DPV CHv株由四川农业大学禽病防治研究中心分离、鉴定保存，该病毒株已与2012年2月23日保存在位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为=CCTCC NO :V201209，分类命名为鸭瘟病毒CH virulent株(DPV CHv);鸭瘟病毒弱毒疫苗株购自成都天邦生物制品有限公司产品，兽药生产许可证证号(2006)兽药生产证字07022号；批准文号兽医生字(2006)070222023);鸭胚成纤维细胞(DEF)用含10%小牛血清的MEM培养基于37°C培养。2质粒和菌株大肠杆菌JM109、质粒pUC18等购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒pEGFP_Cl购自 Clontech03分子生物学试剂Lipofectamine 2000、MEM 和小牛血清购自 Invit本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鸭瘟病毒gE基因转移载体pUC?ΔgE?EGFP，包含转移载体pUC?ΔgE?EGFP的大肠杆菌种(Escherichia?coli)JM109于2012年2月24日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC?NO：M2012033；分类命名为大肠杆菌JM109/pUC?ΔgE?EGFP(Escherichia?coli?JM109/pUC?ΔgE?EGFP)。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：程安春，孙昆峰，常华，汪铭书，陈孝跃，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：
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