一种利用喜树AOC基因转化提高烟草抗冻性能的方法技术

本发明专利技术属于分子生物学以及基因工程技术领域，具体为一种利用喜树AOC基因转化提高烟草抗冻性能的方法。本发明专利技术包含利用喜树丙二烯氧化物环化酶（AOC）基因构建植物表达载体，利用基因工程技术在烟草中过量表达喜树AOC基因，增强烟草抗冻性能。其过程是从喜树中克隆AOC基因，构建了植物高效表达载体，导入农杆菌并遗传转化烟草，测定转基因烟草叶片低温处理后的电导率。本方法可以在烟草中过量表达喜树AOC基因，提高烟草的抗冻性能。

【技术实现步骤摘要】
—种利用喜树AOC基因转化提高烟草抗冻性能的方法
本专利技术属于分子生物学以及基因工程
，具体涉及一种利用基因工程技术提高烟草抗冻性能的方法。
技术介绍
茉莉酸类物质是植物界中普遍存在的一种激素，参与植物发育和逆境胁迫下应激反应的信号传导过程。内源和外源的茉莉酸类化合物能显著提高植物对机械损伤、动物撕咬、病虫害侵染、低温、高盐等不利外界环境的耐受能力。在植物中，茉莉酸类物质的合成途径是从细胞膜上释放的亚麻酸开始，在脂氧合酶、丙二烯氧化物合成酶、丙二烯氧化物环化酶、OPDA (12-0X0-(10, 15Z)-phytodienoic acid)还原酶、β _氧化酶、茉莉酸甲基化酶等一系列酶的催化生成茉莉酸和甲基茉莉酸。其中由于丙二烯氧化物会自发水解，由此丙二烯氧化物环化酶的作用在茉莉酸类物质的合成途径中尤为重要。作为一种重要的模式植物，且易于进行遗传转化，烟草是植物的信号途径研究中的热门对象；作为一种广泛种植的经济作物，烟草的抗逆性能在物种品质和经济价值上具有非常重要的意义。烟草的抗冻研究目前涉及葡萄糖醛酸苷酶(GUS)蛋白，超氧物岐化酶(SOD)蛋白等。相比较而言，利用来源于喜树的茉莉酸类物质合成途径的关键酶丙二烯氧化物环化酶的基因工程来系统性地提高烟草的抗冻性能具有很大的优势(I)在茉莉酸类物质的合成和信号传导研究领域，全世界的研究人员已经进行了几十年的深入研究，其生理作用和生化机制比较清楚，为在基因工程中利用茉莉酸类物质生物合成途径的基因打下了良好的理论和实践基础。(2)提供一种全新的思路，采用转aoc基因提高烟草抗冻性能的方法。 喜树是一种和烟草亲缘关系比较远的植物，来源于喜树的丙二烯氧化物环化酶在烟草中能顺利表达并达到高活性效果，提高了尼古丁含量。这为开展植物基因工程研究提供了一个新的方向。 目前，尚未有任何与本专利申请中所提及的应用基因工程技术把喜树的茉莉酸物质生物合成途径的酶基因尤其是丙二烯氧化物环化酶转到烟草中，提高烟草抗冻性能的相关报道，包括专利和文献。
技术实现思路
本专利技术的第一目的就是提供一种利用基因工程技术提高烟草抗冻性能的方法，该方法将来源于喜树的丙二烯氧化物环化酶基因转到烟草中。本专利技术的第二目的是提供一种高效表达载体，它包含上述喜树的丙二烯氧化物环化酶基因片断。本专利技术的第三目的是提供一种用上述高效表达载体转化的宿主细胞。在实例中该宿主细胞是烟草。本方法的技术方案如下本专利技术分离出的DNA分子，具有编码丙二烯氧化物环化酶的核苷酸序列的核心片断， 该核心片断来源于由申请人在GenBank中登录的喜树iCamptotheca丙二烯氧化物环化酶基因(登录号AY863428)的核苷酸序列,用引物Pl (5’-gg actaRt Atg get get tea tea act tc_3’，酶切位点用下划线表示)和 P2 (5’-ga ggttacc Tea gtc agt gaa gtt agg aa_3’，feiEII酶切位点用下划线表示),采用PCR法可以从喜树cDNA文库中扩增出该核心片断，喜树丙二烯氧化物环化酶基因的cDNA序列见SEQ ID N0:1，其全长 1129bp，开放阅读框位置为第72位碱基到第812位碱基。本专利技术提出的利用转基因技术提高烟草抗冻能力的方法，是利用具有编码喜树丙二烯氧化物环化酶(AOC)的核苷酸序列(Genbank No. :AY863428)的植物表达载体,采用转基因方法在烟草细胞、组织、器官、植株中过量表达喜树丙二烯氧化物环化酶基因的DNA分子。其具体步骤如下(1)采用任何可能的手段(如基因克隆、人工合成基因等方法)获得喜树丙二烯氧化物环化酶基因的核心片断；(2)把喜树丙二烯氧化物环化酶基因核心片断可操作地连于表达调控序列，形成表达载体；(3)采用任何转基因方法转移喜树丙二烯氧化物环化酶基因核心片断到烟草细胞、组织、器官、植株中；(4)在特定的条件下筛选和鉴定转化子；(5)在适合的条件下培养抗冻性能提高的烟草转化子，获得转基因后代。本专利技术涉及的载体包含具有编码喜树丙二烯氧化物环化酶的核苷酸序列的核心片断的DNA。用上述方法获得的生命体，它是抗冻性能提高了的烟草的细胞、组织、器官、植株。在本专利技术中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒等。在本专利技术中，术语“生命体”指烟草的细胞、组织、器官，或植株。在本专利技术中，术语“任何可能的手段”为获得喜树丙二烯氧化物环化酶基因的方法，具体包括同源性克隆(如RT-PCR、RACE等)、文库筛选而后人工合成喜树丙二烯氧化物环化酶基因及其变异体。在本专利技术中，术语“任何转基因方法”包括根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化、发根农杆菌Ri质粒介导基因转化、植物病毒载体介导基因转化、PEG介导基因转化、脂质体介导基因转化、电击法介导基因转化、超声波介导基因转化、显微注射介导基因转化、激光微束介导基因转化、基因枪介导基因转化、花粉管通道介导基因转化、生殖细胞浸泡法介导基因转化。在本专利技术中，术语“在特定的条件下筛选和鉴定转化子”是指在离体培养的条件下用抗生素(卡那霉素、潮霉素、G418等)选择出有抗生素抗性的转化子；可以使用PCR、 Southern杂交、Northern杂交和Western印迹等方法来鉴定转化子。在本专利技术中，术语“在适合的条件下培养抗冻性能提 高的烟草转化子，获得转基因后代”是指对经过鉴定的转化子离体培养，并检测抗冻性能，筛选抗冻性能提高的优良转化子进行培养，获得转基因后代。本专利技术从喜树中克隆丙二烯氧化物环化酶基因核心片断，并构建了植物高效表达载体，导入农杆菌并遗传转化烟草，以提高烟草的抗冻性能，提高了烟草的种质，增强了栽培适宜性。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件， 例如《分子克隆》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照厂商所建议的条件。实施例1 喜树丙二烯氧化物环化酶基因核心片断的合成，及表达载体和工程菌的构建。1、喜树丙二烯氧化物环化酶基因核心片断的获得根据喜树丙二烯氧化物环化酶基因的全长序列，在该基因的内部第72碱基至第812碱基之间设计引物，扩增741bp序列作为基因片断，并根据植物表达载体PCAMBIA1304的多克隆酶切位点，分别设计两条含有5^1和^siEII限制性内切酶位点以及保护碱基的PCR扩增引物，其引物序列为Pl 5' -ggactagtAtggctgcttcatcaacttc-3' (SEQ ID NO:2) ,酶切位点用下划线表示P2 5' -gaggttaccTcagtcagtgaagttaggaa-3' (SEQ ID NO 3) , ifeiEII 酶切位点用下划线表示从喜树的叶片抽提总RNA (上海华舜生物工程有限公司植物RNA提取试剂盒)，反转录成cDNA(TaKaRa RNA PCR Kit)，然后进行PCR扩增，PCR反应体系为50 μ L，包含去离子水， 10XPCR 缓冲液 5yL，dNTP I μ LjMgCl2 3 μ L，引物各 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离出的DNA分子，具有编码丙二烯氧化物环化酶的核苷酸序列的核心片断，该核心片断来源于丙二烯氧化物环化酶基因的核苷酸序列，用引物SEQ?ID?NO:2?和SEQ?ID?NO:3，采用PCR法从喜树cDNA文库中扩增获得，喜树丙二烯氧化物环化酶基因的cDNA序列见SEQ?ID?NO：1，其全长1129bp，开放阅读框位置为第72位碱基到第812位碱基。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：皮妍，崔勇，蒋科技，孙小芬，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：