本发明专利技术公开了一种通过基因融合降低Vip3蛋白对转基因植物毒性的方法，1）、将一个多肽（polypeptide）基因的C端与基因vip3的N端直接相连；中间加以4个氨基酸组成的连接肽连接；2）、融合基因在植物细胞表达的融合蛋白质不集中在植物的细胞膜上。Vip3蛋白为以下任意一种：为Bt营养期杀虫蛋白Vip3类蛋白的任意一种；为SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列；为与SEQ?ID?NO：?1具有至少70%相似性的氨基酸序列。多肽（polypeptide）为绿色荧光蛋白GFP；连接肽为Gly-Asp-Pro-Thr。将本发明专利技术所得的融合基因转入植物中，从而获得转基因抗虫植物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程领域，具体涉及ー种构建Vip3类蛋白融合基因的方法及其转入植物中构建抗虫转基因植物的应用。
技术介绍
苏云金芽孢杆菌Bt是世界上应用最广泛的杀虫微生物，它在生长过程中能产生一系列的杀虫毒素，其中研究最为深入、应用最多的是其杀虫晶体蛋白(InsecticidalCrystal Poteins, ICPs)。然而，在实际应用中有些重要的农作物害虫(如小地老虎、茶尺蠖)对ICPs并不十分敏感，并且由于Bt产品的不合理使用，已有小菜蛾等害虫对Bt制剂产生了不同程度的抗性(Zhao et al. , 2003 ; Griffitts et al. , 2001 )。因此,寻■找具有与ICPs不同杀虫作用方式的蛋白，对于扩大杀虫谱、延缓害虫抗药性的产生具有重要的理论意义和实用价值。营养期杀虫蛋白(VegetativeInsecticidal Protein, VIPs)是一种新型Bt 杀虫蛋白，它是Bt从对数生长中期开始分泌、直至稳定前期达到最高峰的胞外毒素。VIPs主要分为Vipl、Vip2和Vip3三种，Vipl和Vip2构成ニ元毒素，对鞘翅目叶甲科昆虫具有杀虫特异性，而Vip3对鳞翅目害虫有较广谱的杀虫活性(Schn印f et al.，1998)。Vip3与已知的ICPs没有序列同源性和结构相似性(Estruch et al.，1996)，杀虫机理也不尽相同。与ICPs蛋白晶体不同，Vip3为可溶性蛋白，不需通过昆虫中肠的消化即可直接起作用。研究表明，其N端是一段信号肽序列，可以使Vip3蛋白识别并结合在敏感昆虫中肠上皮细胞膜上，造成膜穿孔，通过诱发中肠细胞凋亡，最终导致昆虫死亡(Lee et al.，2006)。Vip3和广泛使用的ICPs类Cry蛋白无交互抗性。因此，Vip3蛋白作为新的杀虫资源在研究和应用方面将具有巨大的潜力，可用于构建和研制高效、广谱的杀虫蛋白基因来进行抗性害虫的有效防治。目前，Vip3转基因 作物的研发和应用已成为新的研究热点。美国先正达(Syngenta)公司在全球最早开展了 Vip3转基因研究，已将Vip3成功地应用于转基因杀虫植物的构建，并在棉花和玉米中首先得到应用。2003年研制出成功表达Vip3毒蛋白的棉花品种C0T102(Artim, 2003) ;2007年培育出转vip3a20的转基因玉米品系MIR162。2010年，先正达公司研制的含Vip3蛋白的棉花和玉米获得美国环境保护署的批准(Syngenta,2010)，可将其用于防治对Cry基因产生抗性的鳞翅目害虫，极大地拓宽了 Bt转基因作物的抗虫谱。现在，美国已开始种植含有Vip3蛋白的棉花品种和玉米杂交种。在国家转基因专项的资助下，我国也积极开展了对Vip3基因的研究与利用。浙江大学与山西省农业科学院棉花研究所等単位合作，利用国内获得的新型Vip3基因及其改造成果，构建具有自主知识产权的重组vip3与cryIA融合基因从而获得抗虫转基因植物，可望实现对棉花、玉米、水稻等主要作物鳞翅目害虫广谱高抗的育种目标。尽管如此，在转基因作物构建的实际操作中，仍然存在一些急需解决的技术性问题。例如，研究人员发现単独的vip3基因转入植物后，所获得的高表达Vip3蛋白的转基因植株在生长上较迟缓，容易出现白化现象。这是由于在转基因植物中直接表达Vip3蛋白后，该蛋白由于信号肽的分泌作用大量聚集并结合在植物细胞膜上并形成孔道，从而对植物细胞形成一定的损坏，影响其生长发育。这样还导致的另ー后果是，转基因植物的抗虫性能也不高。所用參考文献具体如下卢雄斌，龚祖坝(1998)植物转基因方法及进展。生命科学3:125-131。刘凡，王国英，曹鸣庆(2003)农杆菌介导的植物原味转基因方法研究进展。分子植物育种1:108-116。Artim L (2003) Petition 03 - 155 - Olp for the determination ofnon_reguJ_ated status: Lepidopteran insect protected Vip3 cotton transformationevent Cotl02 (抗鳞翅目昆虫的Vip3转基因棉Cotl02)。Estruch J, Warren G，Mullins M，Nye G，Craig JK (1996) Vip3, a novelBacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with a wide spectrum ofactivities agrainst lepidopteran insects. Proc Natl Acad Sci U S A93: 5389 -5394. Vip3 (一种对鳞翅目昆虫有广谱抗性的新型苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白；美国科学院院刊 93: 5389 - 5394. Vip3)。Griffitts SJj Whitacre LJj Stevens ED, Aroian VR (2001) Bt toxinresistance from loss of a putative carbohydrate-modifying enzyme. Science 293:860-864 (由于缺失推定的糖修饰酶而产生的Bt毒素抗性；科学293: 860-864)。Lee KMj Miles P，Chen JS (2006) Brush border membrane bindingproperties of Bacillus thuringiensis Vip3 toxin to Heliothis virescens andHelicoverpa zea midguts. Biochem Bioph Res Co 339: 1043-1047 (苏云金芽抱杆菌Vip3毒素对烟蚜夜蛾和谷实夜蛾`的刷状缘膜受体结合性质；生化和生理研究通信339:1043-1047)。Schnepf E, Crickmore N，Van Rie J, Lereclus D, Baum J (1998) Bacillusthuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mo_l Biol Rev 62:775 - 806 (苏云金芽孢杆菌及其杀虫晶体蛋白；微生物分子生物学研究62: 775 - 806)。Syngenta. EPA approves Syngenta’s VipCot cotton for natural refuge[EB/OL]. [2010-06-02] http://news, agropages. com/News/NewsDetai1---2482. htm，先正达(EPA通过先正达的VipCot棉用于自然庇护)。Syngenta. USDA deregulates breakthrough Syngenta Seeds corn trait. [EB/OL]. [2010-04-22] http://news, agropages. com/News/NewsD本文档来自技高网...
【技术保护点】
通过基因融合降低Vip3蛋白对转基因植物毒性的方法，其特征是：1）、将一个多肽（polypeptide）基因的C端与基因vip3的N端直接相连；中间加以4个氨基酸组成的连接肽连接；2）、融合基因在植物细胞表达的融合蛋白质不集中在植物的细胞膜上。
【技术特征摘要】
1.通过基因融合降低Vip3蛋白对转基因植物毒性的方法，其特征是 1)、将一个多肽(polypeptide)基因的C端与基因vip3的N端直接相连；中间加以4个氨基酸组成的连接肽连接； 2 )、融合基因在植物细胞表达的融合蛋白质不集中在植物的细胞膜上。2.根据权利要求1所述的通过基因融合降低Vip3蛋白对转基因植物毒性的方法，其特征是 所述Vip3蛋白为以下任意一种 为Bt营养期杀虫蛋白Vip3类蛋白的任意一种； 为SEQ ID NO 1所不的氣基酸序列； 为与SEQ ID NO:1具有至少70%相似性的氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的通过基因融合降低Vip3蛋白对转基因植物毒性的方法，其特征是 所述多肽(polypeptide)为绿色突光蛋白GFP ； 所述绿色荧光蛋白GFP为SEQ ID NO...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈志成，李京，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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