本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及花生紫黄质脱环氧化酶基因，核苷酸序列见序列表中序列1。花生紫黄质脱环氧化酶基因的氨基酸序列，氨基酸序列见序列表中序列2。花生紫黄质脱环氧化酶在保护光合机构中的应用。将花生紫黄质脱环氧化酶基因转染到烟草得到转基因植株，在过剩光能胁迫下，转基因植株有着比野生型植株更高的NPQ和叶黄素循环的脱环氧化状态，表明在过剩光能条件下，AhVDE的过量表达使叶黄素循环组分相对含量发生改变从而导致了脱环氧化状态的改变，提高了叶黄素循环的热耗散能力。转基因植株耗散过剩光能的能力增强使PSII激发能压力减少，从而减轻了PSII和PSI在过剩光能胁迫下光抑制程度，最终保护了光合机构。
【技术实现步骤摘要】
花生紫黄质脱环氧化酶基因及其编码蛋白和应用
本专利技术属于生物
，特别涉及花生紫黄质脱环氧化酶基因(JAKM)和氨基酸序列及其在光系统保护方面的应用。
技术介绍
花生是重要的油料作物和经济作物，在我国农业生产乃至整个国民经济中具有重要地位。高温和强光往往会引起光抑制，影响了花生光合产物的积累，进而影响荚果的发育，产量降低。随着环境的不断恶化，如何提高作物防御光破坏能力已成为主要目标之一。当前发展迅速的基因工程技术为植物遗传改良提供了新的途径，利用在热耗散过程中起重要作用的基因进行遗传转化是获得新种质的重要手段。因此，发掘缓解光抑制方面的重要基因资源对提高花生产量和品质具有重要的意义，将为花生的遗传改良奠定坚实基础。光能被捕获以后，主要有三条相互竞争的出路:光化学电子传递、叶绿素荧光发射和热耗散。叶绿素荧光猝灭与光合作用的量子效率呈负相关，表明了一种调节机理，即降低光饱和条件下的PSII的光化学效率，可以避免光抑制、光破坏的发生。但由于叶绿素荧光只消耗捕获光能的很少一部分，因此光化学反应受阻时，热耗散就成了消耗过剩光能的重要途径，其中，依赖叶黄素循环的热耗散在逆境胁迫中对植物起着非常重要的保护作用。叶黄素循环在自然界中广泛存在，主要定位于所有高等植物、蕨类植物、苔藓以及部分藻类植物的类囊体膜上。其过程是指叶黄素三个组分(紫黄质、花药黄质和玉米黄质)依光照条件的改变而相互转化的过程。当光合机构吸收的光能不能全部用于碳同化时，含双环氧的紫黄质(Viofaxanthin ;V)在紫黄质脱环氧化酶(violaxanthin de-epoxidase, VDE)的催化下，通过单环氧的花药黄质(Antheraxanthin ；A)转化为无环氧的玉米黄质(zeaxanthin ；Z);而在弱光条件下，Z会在玉米黄质环氧化酶(zeaxanthin epoxidase, ZE)的催化下,通过A转化为Z。其中A和Z的形成能够诱导捕光复合物形成耗散状态，有利于耗散过剩的激发能，使光合机构免受过量光能破坏，提高植物的抗逆性。成熟的VDE属于类囊体腔蛋白，这类蛋白前体在核糖体被合成后，需要通过转运肽的运输作用，连续通过叶绿体外膜、内膜进入基质，再通过类囊体膜，最后到达类囊体腔内，与类囊体膜结合后催化由紫黄质(V)向玉米黄质(Z)的脱环氧化反应。目前在花生中还未见VDE基因克隆及其功能研究的报道。
技术实现思路
为了进一步研究各种植物的紫黄质脱环氧化酶对叶黄素循环过程的影响，本专利技术提供了一种花生紫黄质脱环氧化酶GAKM)基因。本专利技术还提供了由花生紫黄质脱环氧化酶基因编码蛋白的氨基酸序列。本专利技术通过将必切5'基因转入烟草中，可以显著提高转基因植株的脱环氧化水平，保护光系统。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用下述技术方案予以实现: 一种花生紫黄质脱环氧化酶基因，碱基序列见序列表中序列I。克隆所述花生基因的引物名称与序列如下:VDE-F:5’-TCTAGAATGGCAATCTTGACTGCAAAT-3’ (JbaI)；VDE-R:5’-GGATCCCTACCTTAGTTTTCGCAAAG-3’ (BamHI)。所述的花生紫黄质脱环氧化酶基因编码蛋白的氨基酸序列见序列表中序列2。所述的表达蛋白在保护光合机构中的应用。将花生必切5'基因在烟草中超量表达，转基因幼苗的叶黄素循环脱环氧化状态(A+Z) / (V+A+Z)在高温强光胁迫条件下可达到80% ;低温弱光条件下达到70%。与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果是: 1、本专利技术从花生中克隆了 JAKM基因并分析得到其氨基酸序列。2、转基因植株有着比野生型植株更高的NPQ和叶黄素循环的脱环氧化状态；本专利技术将KM基因在烟草过量表达后在高温强光胁迫下可显著提高叶黄素循环中的脱环氧化状态；Ah-4和Ah-9转基因株系中(A+Z) / (V+A+Z)分别增加到76%和80% ； 3、在低温弱光条件下其(A+Z) / (V+A+Z)可增加至70%，与在烟草中超表达的番茄紫黄质脱环氧化酶基因(ZeKM)相比，其作用效果更加明显，提高了转基因植株依赖叶黄素循环的热耗散能力。4、转基因植株耗散过剩激发能的能力增强，从而减轻了 PSII和PSI在过剩光能胁迫下光抑制程度，最终保护了光合机构。结合附图阅读本专利技术的【具体实施方式】后，本专利技术的其他特点和优点将变得更加清λ.Μ/E.ο`【附图说明】 图1为PCR产物经琼脂糖凝胶电泳图谱;A，AhVDE的中间保守区片段的PCR扩增；B，AhVDE 3’端片段的PCR扩增'C，AhVDE 5’端片段的PCR扩增；D，必切5'基因全长的PCR扩士豳>曰ο图2为花生紫黄质脱环氧化酶基因所编码蛋白的疏水性进行分析； 图3为酶蛋白为膜蛋白，有两个跨膜信号区； 图4必切5'在不同器官中的表达；F^; R:根；S:莖；L:叶片；Fr:果实 图5野生型花生植株在高温强光处理过程中KM表达分析； 图6高温强光胁迫条件下野生型烟草和转基因株系叶片的NPQ值变化(A)及叶黄素循环的脱环氧化状态(B)。图7低温弱光胁迫条件下野生型烟草和转基因株系叶片的叶黄素循环的脱环氧化状态(A+Z) / (V+A+Z)。【具体实施方式】下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步说明: 实施例1 1.扩增花生紫黄质脱环氧化酶(JAKM) 利用RNA试剂盒(购于天根生化科技有限公司)提取花生叶片RNA并反转录。根据已知同源基因的高度保守区，设计简并引物(5’ -CCTGAYGARACKGAATGTC-3’，5’ -TACCAGTCATCYTGRTAGTG-3’)，进行聚合酶链式反应(PCR)，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段与估计的片段大小符合(489 bp)(见图1 A)。将所得的PCR产物与pMD18-T克隆载体连接，转化大肠杆菌。通过菌落PCR快速筛选得到阳性克隆，提取阳性克隆的质粒，利用载体内部的酶切位点切割质粒，得到与PCR产物大小相同的条带。将鉴定好的菌液寄往上海生物工程公司测序，用Blast，DNAman或DNAclub软件将所得片段序列与来源于其他植物的同源序列进行序列比较，确定该片段为所要克隆的目的基因的中间片段。根据所得的必切5'基因中间片段，设计特异引物VDE2(5’ -ATTTCACACAGAAGACAAC-3’)，和大连宝生物公司提供的接头引物B26进行PCR扩增，得到一条大小895 bp的条带，与目的基因的3’端片段大小相符(见图1B)。连入pMD18-T克隆载体，经酶切鉴定，测序。根据所得的必切5'基因中间片段，设计特异引物VDEl(5’ -CAAGTTTGTTGTCTTCTGTGTG-3)，利用大连宝生物公司提供的5’ RACE试剂盒进行克隆，得到一条为692 bp的条带(见图1C)。同样的方法与pMD18-T克隆载体连接，提取质粒，酶切鉴定，测序。根据所获得的中间片段、5’片段和3’片段拼接出'全长cDNA，据此设计特异引物 VDE-F 和 VDE-R:VDE-F:5’-TCTAGAATGGCAATCTTGACTGCAAAT-3’ (JbaI)；VDE-R:5’-GGATCCCTACCTTAGTTTTCGCA本文档来自技高网...
【技术保护点】
花生紫黄质脱环氧化酶基因，其碱基序列如序列表中序列1所示。
【技术特征摘要】
1.花生紫黄质脱环氧化酶基因，其喊基序列如序列表中序列I所不。2.扩增花生紫黄质脱环氧化酶基因的引物，其特征在于引物名称与序列如下:VDE-F:5’-TCTAGAATGGCAATCTTGACTGCAAAT-3’ (JbaI)；VDE-R:5’-GGATCCCTACCTTAGTTTTCGCAA...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨莎，万书波，李新国，郭峰，孟静静，张佳蕾，黄超，杨连群，
申请(专利权)人：山东省农业科学院生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：山东;37
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