一种基因工程技术领域的基于巨大芽孢杆菌的亚硝酸盐还原酶大亚基外源表达方法，通过将测序得到的亚硝酸盐还原酶大亚基的基因序列通过引物序列扩增并连接到大肠杆菌表达载体中，从而获得重组表达载体，并进一步将重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选到含有目的基因的转基因重组菌。本发明专利技术克服现有技术中由于亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列在天然的巨大芽孢杆菌中表达量非常低，严重限制使用效果，应用基因工程菌表达本发明专利技术所述的亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列，实现极大的提高该基因的表达量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是一种基因工程
的方法，具体是一种亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列、含有该基因的重组载体、重组菌以及利用该重组菌产生该基因的表达产物及其应用。
技术介绍
亚硝酸盐还原酶是一类催化亚硝酸盐还原的酶。亚硝酸盐广泛存在于腌制食物或饲料中。食品中亚硝酸盐含量过高，会使体内血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，降低血液载氧能力，造成高铁血红蛋白血症，对人体造成严重危害。亚硝酸盐还可在人体内与仲胺、叔胺和氨基化合物反应形成强致癌物亚硝胺化合物，从而诱发消化系统癌变。鉴于土壤和食品中超标亚硝酸盐盐污染可引起环境与食品安全问题，人们正在努力寻找有效控制或降解亚硝酸盐的方法，生物酶法成为消除食品亚硝酸盐的一条切实可行的途径。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的上述不足，提出一种，克服现有技术中由于亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列在天然的巨大芽孢杆菌中表达量非常低，严重限制使用效果，应用基因工程菌表达本专利技术所述的亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列，实现极大的提高该基因的表达量。本专利技术是通过以下技术方案实现的:本专利技术涉及一种亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，该亚硝酸盐还原酶大亚基的基因序列长度为2415个碱基对，编码804个氨基酸，分子量约为88.0KD。本专利技术涉及一种，将测序得到的亚硝酸盐还原酶大亚基的基因序列(Bm-Nas D)通过引物序列扩增并连接到大肠杆菌表达载体中，从而获得重组表达载体，并进一步将重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选到含有目的基因的转基因重组菌。所述的测序是指:以巨大芽孢杆菌NCT-2的基因组DNA为模板，用上述两对引物进行PCR扩增，然后将扩增产物进行电泳检测；并将扩增产物切胶回收后连接到pMD 19-T (Simple)载体上进行测序。所述的引物序列扩增采用的引物为PCR扩增采用的引物的5'端分别设计了 EcoRI和Stu I酶切位点用于连接到表达载体，即:正向引物NasD-Eco R 1-F:5' -CGGAATTCATGCAAAAAAAGMACTCGTATTGAT-3'，以及反向引物 Nas D-Stu 1-R:5' -AAGGCCTTTATGATGTGACAACTGTTTCGAACAG-3'组成。所述的大肠杆菌表达载体为pET-41a载体。所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21 (DE3)。所述的巨大芽孢杆菌NCT-2 (Bacilus megaterium),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学微生物研究所；保存日期为2011年3月21日，保藏编号为CGMCC N0.4698。所述的重组表达载体是指:重组表达质粒pET-41a-Bm_Nas D。所述的转基因重组菌是指:含有重组表达质粒pET-41a-Bm_Nas D的大肠杆菌BL21(DE3)。本专利技术涉及上述亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列的应用，将其用于表达目的蛋白产物。 技术效果本专利技术与现有技术相比，具有以下优势:1、本专利技术提出一种全新的亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列；2、本专利技术通过构建重组表达菌株，实现了目的蛋白的外源表达，可以显著提高表达量;3、本专利技术采用Western Blot技术,可以对表达蛋白进行灵敏检测，可检测低至l-5ng(最低可至IO-1OOpg)的蛋白。【附图说明】图1PCR扩增电泳示意图。图2含有重组质粒pET-4Ia-Bm-Nas D的DH5 a平板示意图。图3重组表达质粒酶切电泳示意图。图4重组菌诱导表达目的蛋白的SDS-PAGE示意图。图5重组菌诱导表达目的蛋白的Western Blot-His ? Tag图。【具体实施方式】下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。 实施例1巨大芽抱杆菌(Bacilusmegaterium)NCT-2 的培养巨大芽孢杆菌NCT-2分离自上海市崇明岛设施栽培12-15年的大棚，保藏编号为CGMCC N0.4698。将该菌接种于LB液体培养基中，32°C培养OD6tltl至1.5左右，离心收集菌体用于提取细菌的基因组DNA。所述的LB液体培养基组分为:蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaC110g，去离子水1L，PH6.8-7.2。LB固体培养基即为在LB液体培养基的基础上添加15_20g的琼脂。 实施例2亚硝酸盐还原酶大亚基的基因序列(Bm-Nas D)序列验证根据全基因组测序结果，设计PCR引物:正向引物Nas D-F: 5' -ATGCAAAAAAAGAAACTCGTATTGAT-3'反向引物Nas D-R: 5' -TTATGATGTGACAACTGTTTCGAACAG-3'以巨大芽孢杆菌 NCT-2的基因组DNA为模板，用上述两对引物进行扩增。PCR条件为:95°C预变性3min ;94°C变性45s，53°C退火30s，72。。延伸lmin30s ;30个循环后72。。终延伸IOmin0将PCR扩增产物进行电泳检测，结果表明获得片段约为2.4kb，结果见图1 ;然后将PCR产物切胶回收后连接到pMD19-T (Simple)载体上送公司测序。经测序后得到的核昔酸序列与基因组测序结果相吻合，即为本专利技术序列表中SEQ ID N0.1。 实施例3重组表达载体的构建根据测序得到的亚硝酸盐还原酶大亚基的基因序列(Bm-Nas D)，设计相应引物扩增该基因并连接到pET-41a表达载体上，然后转入大肠杆菌BL 21 (DE 3)进行诱导表达。设计引物如下:正向引物Nas D-Eco R I_F:5' -CGGAATTCATGCAAAAAAAGAAACTCGTATTGAT-3'反向引物Nas D-Stu I_R:5' -AAGGCCTTTATGATGTGACAACTGTTTCGAACAG-3'上下游引物的5'端分别设计了 EcoR I和Stu I酶切位点用于连接到表达载体pET-41a，用含有酶切位点的引物扩增亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列，回收PCR产物Bm-Nas D'并连接T载。将连接产物转入DH5 a大肠杆菌感受态细胞内，挑取阳性克隆(图2)摇菌并回收其质粒，然后用EcoR I和Stu I双酶切，回收含有亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列的基因片段B m-Nas D'。用相同内切酶酶切表达载体pET_41a后与Bm-Nas D'片段混合，用T4 DNA Ligase进行过夜连接，连接产物转化到DH5 a大肠杆菌感受态细胞，通过菌落PCR筛选含有重组表达质粒pET-41a-Bm-Nas D的阳性克隆。 实施例4重组菌的构建及目的蛋白的表达将含有重组表达质粒pET-41a-Bm_Nas D的DH5 a大肠杆菌接入到卡那霉素浓度为50 iig/mL的LB液体培养基中，过夜培养并提取其质粒。用Eco R I和Stu I酶对提取质粒37°C酶切30min，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳验证(见图3)。将提取的重组表达质粒pET-41a-Bm_Nas D转化到大肠杆菌BL21 (DE3)菌株的感受态细胞中，挑取阳性克隆于卡那霉素浓度为50 u g/mL本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所/Jn o2.一种基于巨大芽孢杆菌的亚硝酸盐还原酶大亚基外源表达方法，其特征在于，将测序得到的亚硝酸盐还原酶大亚基的基因序列通过引物序列扩增并连接到大肠杆菌表达载体中，从而获得重组表达载体，并进一步将重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选到含有目的基因的转基因重组菌。3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的测序是指:以巨大芽孢杆菌NCT-2的基因组DNA为模板，用上述两对引物进行PCR扩增，然后将扩增产物进行电泳检测；并将扩增产物切胶回收后连接到pMD19-T (Simple)载体上进行测序。4.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的引物序列扩增采用的引物为PCR扩增采用的引物的5'端分别设计了 EcoR I和Stu I酶切位点用于连接到表达载体，即:正向引物 Nas D-Eco R 1-F: 5' -C...
【专利技术属性】
技术研发人员：周培，冯海玮，支月娥，孙玉静，陆伟，刘群录，时唯伟，初少华，卫星，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。