一种产多种脂肽类抗生物质的甲基营养型芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种产多种脂肽类抗生物质的甲基营养型芽孢杆菌BH21，其保藏号为CGMCCNo.11840，该菌株能产生Iturin类、Fengycin类、Sufactin类和Yndj类脂肽类抗生物质，本发明专利技术还提供了该菌株在防治番茄灰霉病中的应用，其对番茄灰霉病菌有良好的防效。该菌株及其微生物制剂的使用，可以降低番茄生产过程中化学农药的施用，具有良好的生态和社会效益。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物发酵及生物防治
，具体涉及一种产多种脂肽类抗生物质的甲基营养型芽孢杆菌BH21及其应用。
技术介绍
随着化学农药和传统抗生素的大量使用，食品安全和环境问题越发突出，生物防治在农业生产中的应用逐渐受到重视。近年来，微生物来源的脂肽被用于抗真菌病方面的研究有了很大的进展，相对于化学农药和传统抗生物质而言，脂肽类具有对动植物无害、可生物降解以及不易使病原微生物产生，其中枯草芽孢杆菌（Bacillus.subtilis）、地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）以及蜡状芽孢杆菌（B.cereus）是产脂肽的主要菌种，产生的脂肽类抗生素主要有表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturin)和丰原素（Fengycin）三大类。不同类型的脂肽类抗生物质往往具有不同的生物活性。Iturins和fengycins对真菌具有较强的拮抗能力；surfactins主要对细菌、病毒和支原体有抑制作用，对真菌没有太大的抑制作用，但其能够增强Iturins或fengycins对真菌的医治效果，还能在植物根部形成一层生物膜保护植物根部免受病原菌的入侵。不同的菌种产生的脂肽类物质不同，曹云（SQR9微生物有机肥防治黄瓜土传枯萎病的效应与机制研究，南京农业大学，2011）发现SQR9菌株含有Bacillomycin和Fengcin两种脂肽类抗生素，Ye等（Identificationofantifungalsubstance（IturinA2）producedbyBacillussubtilisB47anditseffectonSouthernCornLeafBlight，JournalofIntegrativeAgriculture，2012，11（1）：90-99.）鉴定枯草芽孢杆菌B47发酵液的主要成分为Iturin。目前关于甲基营养型芽孢杆菌产脂肽类物质的研究较少，中国专利ZL201310466625.2公开了一种产脂肽类抗生物质的甲基营养型芽孢杆菌B.methylotrophicus9912，其产生的脂肽化合物为6-AbuC16fengycin、anteiso-C15surfactin和anteiso-C15surfactinmethylester，即仅包含Surfactin和Fengcin两种类型的脂肽，对黄瓜灰霉病及苹果腐烂病等有防治效果。
技术实现思路
基于以上技术现状，本专利技术的目的是提供一株新的甲基营养型芽孢杆菌BH-21，并提供其应用，该菌株能产生多种脂肽类物质，对番茄灰霉病具有显著的防治效果。本专利技术采用的技术方案如下：一种产多种脂肽类抗生物质的甲基营养型芽孢杆菌BacillusmethylotrophicusBH21，该甲基营养型芽孢杆菌于2015年12月09日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏号为CGMCCNo.11840，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。该甲基营养型芽孢杆菌BH21的16sRNA序列在Genebank的登录号为KT889363，其gyrB基因序列在Genebank的登录号为KT889364。该甲基营养型芽孢杆菌BH21含有产生脂肽类抗生物质的基因，包括ituA、ituB、ituC、ituD，fenD，srfAB和yndJ基因。该甲基营养型芽孢杆菌BH21产生Iturin类、Fengycin类、Sufactin类和Yndj类脂肽类抗生物质。本专利技术还提供了所述的甲基营养型芽孢杆菌BH21在防治番茄灰霉病中的应用。具体地，将所述甲基营养型芽孢杆菌BH21的发酵液用于生物防治，所述发酵液由以下步骤制得：按体积比3%的接种量将培养好的种子液接种到大量发酵培养基中，180r/min，32℃培养72h，得到发酵液，即可用于生物防治。所述种子液通过下述方法获得：将保存的甲基营养型芽孢杆菌BH21划线转接到ZoBell's2216E培养基平板中，置于培养箱28℃恒温培养2天；将获得的甲基营养型芽孢杆菌BH21的菌苔接种到PB液体培养基中，28℃摇床振荡培养18h得到种子液。所述的大量发酵培养基中包含：蔗糖20g，NH4NO32g，KH2PO43g，Na2HPO410g，MgSO4·7H2O0.2g，酵母粉0.2g，CaCl20.7μg，MnSO4·4H2O1μg，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2。本专利技术菌株能产生多种脂肽类抗生物质，具有显著的防治番茄灰霉病的效果，防效可高达95%以上。附图说明图1是PDA平板上BH21对番茄灰霉病菌的拮抗作用；图2是甲基营养型芽孢杆菌BH21菌落形态；图3是甲基营养型芽孢杆菌BH21菌体形态；图4是基于16SrDNA序列的BH21系统发育树；图5是基于gyrB基因序列的BH21系统发育树；图6是BH21中脂肽类抗生物质的分子鉴定；图7甲基营养型芽孢杆菌BH21发酵液的HPLC指纹图谱。具体实施方式实施例1甲基营养型芽孢杆菌BH21的筛选从采自中国渤海的海水和海泥中分离细菌，分离培养基（ZoBell's2216E）为：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸高铁0.01g，琼脂16g，陈海水1000mL，pH值7.6-7.8。从分离平板上挑取菌落形态不同的菌株，分别与番茄灰霉病菌做平板对峙实验，将能出现抑菌圈的菌株定为有拮抗作用，共筛选出41株有拮抗作用的细菌，依次编号为BH1-BH41。采用平板对峙法进行复筛并记录抑菌圈直径，其中BH21抑菌带达到15mm（图1），对灰霉病菌的拮抗作用显著。实施例2拮抗菌株BH21的菌落形态及生理生化鉴定根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》中记载的实验内容和实验方法，对筛选的保藏号为CGMCCNo.11840的菌株进行菌种鉴定。菌落形态观察在ZoBell's2216E细菌培养基上划线，于恒温培养箱中28±2℃培养3天，观察菌落形态。保藏号为CGMCCNo.11840的菌株的菌落呈凸起、乳白色、边缘缺刻状（图2）。挑取培养3天的菌落进行革兰氏染色后，在光学显微镜的100倍油镜下观察，保藏号为CGMCCNo.11840的菌株的菌体长杆状、中生芽孢、革兰氏染色阳性（图3）。耐盐试验：向培养基中分别加入NaCl，使含盐量为2.5%、5%、7.5%，。甲基营养型芽孢杆菌BH21在含NaCl2.5%、5%、7.5%的培养基中生长良好，在含NaCl10%，12.5%的培养基中生长缓慢，7天后长出菌苔。耐甲本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产多种脂肽类抗生物质的甲基营养型芽孢杆菌BH21，该甲基营养型芽孢杆菌于2015年12月09日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏号为CGMCC No.11840。

【技术特征摘要】
1.一种产多种脂肽类抗生物质的甲基营养型芽孢杆菌BH21，该甲基营养型芽孢杆菌于
2015年12月09日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏号为
CGMCCNo.11840。
2.根据权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌BH21，其特征在于：其16sRNA序列在
Genebank的登录号为KT889363，其gyrB基因序列在Genebank的登录号为KT889364。
3.根据权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌BH21，其特征在于：其含有产生脂肽类抗
生物质的基因，包括ituA、ituB、ituC、ituD，fenD，srfAB和yndJ基因。
4.根据权利要求3所述的甲基营养型芽孢杆菌BH21，其特征在于：其产生Iturin类、
Fengycin类、Sufactin类和Yndj类脂肽类抗生物质。
5.权利要求1-4任一项所述的甲基营养型芽孢杆菌BH21的应用，其特征在于用于防治
番茄灰霉病。
6.根据权利要求5所述的应用，...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏新燕，段普凡，贾振华，黄亚丽，
申请(专利权)人：河北省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：河北;13