一种新型致病性蜡样芽孢杆菌HB‑SS‑1及其培养方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种新型致病性蜡样芽孢杆菌HB‑SS‑1及其培养方法和应用，所述菌株于2016年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2016672。本发明专利技术人对该菌株进行了一系列生物学特性试验如：细菌纯化培养、涂片染色镜检、生化试验、药敏试验、PCR鉴定、动物试验、疫苗免疫保护试验。试验结果证实该菌株16SrDNA序列与炭疽杆菌部分菌株序列一致，通过动物实验证明HB‑SS‑1有较强毒力，能够致死实验小白鼠，该毒株可作为以后防疫麋鹿细菌病的候选疫苗菌株，可用于制备蜡样芽孢杆菌病疫苗。

【技术实现步骤摘要】
一种新型致病性蜡样芽孢杆菌HB-SS-1及其培养方法和应用
本专利技术涉及菌株领域，具体涉及一种新型致病性蜡样芽孢杆菌HB-SS-1及其培养方法和应用。
技术介绍
蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus，B.C)在土壤等环境中广泛存在，是一种需氧型的芽孢杆菌，其产生丰富的蛋白酶、SOD、淀粉酶及抑菌物质等代谢产物。微生态制剂，以蜡样芽孢杆菌为主要细菌，可以克服很多副作用，例如使用抗生素作为饲料和药品添加剂所带来的副作用，人和动物肠道微生态系统失调、免疫力下降、药物残留及产生抗药性等。B.C菌类制剂大多为非消化性药剂或食品添加剂，能选择性促进生活在肠道的微生物的活性，同时抑制肠道内有害病菌的生长，降低宿主染病的机会，使宿主保证健康。另外，B.C菌在生长过程中还会产生有益的代谢产物，刺激和促进宿主的生长。B.C菌虽然在其作为有益菌方面已获得了长足的发展和足够的重视，但是B.C菌也是一种条件致病菌，在一定旳条件下也会对动物机体造成很强的致病性，因此它危害也应该引起我们足够的重视。研究表明，该菌同昆虫病原菌苏云金杆菌、人畜病原菌、炭疽芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、韦氏芽抱杆菌组成芽孢杆菌属蜡样芽孢杆菌组，它们的形态特征、生理生化特征非常相似并有着极高的同源性，该菌也曾被多次报道引起人食物中毒、以及在养殖过程中引发部分动物疾病等。鉴于B.C菌包含有益菌株和致病性菌株，因此在使用前应首先确定菌株是否为致病菌株，确保其安全性。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种新型致病性蜡样芽孢杆菌HB-SS-1及其培养方法和应用。为实现上述目的，专利技术人从发病麋鹿群中分离到了一株新型致病性蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)HB-SS-1，所述菌株于2016年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武昌珞珈山，保藏编号为：CCTCCNO：M2016672。所述(Bacilluscereus)HB-SS-1的16SrDNA序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术还提供了上述新型致病性蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)HB-SS-1的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、培养基配制TSA固体培养基配制：准确称取TSA粉末40g，溶于940mL蒸馏水，充分摇匀后121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却至50-60℃时，加入过滤除菌的羊血清60mL，混合均匀后倒板备用；TSB液体培养基配制：准确称取TSB粉末30g，溶于940mL蒸馏水，充分摇匀后121℃高压蒸汽灭菌15min，临用前加入过滤除菌的羊血清60mL即可；S2、分离纯化选取发病麋鹿的肺、胸水、心包液、关节液接种TSA/NAD固体培养基，置37℃、5％CO2条件下培养24-48小时，挑取乳白色的圆形光滑小菌落涂片，革兰氏染色镜检，选取革兰氏阳性小杆状菌，再进行两次TSA/NAD固体培养基亚克隆培养。本专利技术人对该菌株进行了一系列生物学特性试验如：细菌纯化培养、涂片染色镜检、生化试验、药敏试验、PCR鉴定、动物实验。试验结果证实该菌株16SrDNA序列与炭疽杆菌部分菌株序列一致，通过动物实验证明HB-SS-1有较强毒力，能够致死实验小白鼠，该毒株可作为以后防疫麋鹿细菌病的候选疫苗菌株，可用于制备蜡样芽孢杆菌病疫苗。附图说明图1为本专利技术实施例中HB-SS-1菌株培养基生长形态。图2为本专利技术实施例中HB-SS-1菌株革兰氏染色镜检。图3为本专利技术实施例中HB-SS-1菌株16SrDNA基因进化树。表1生化鉴定试验结果注：″+″表示只产酸或阳性，″-″表示阴性表2HB-SS-1株药敏试验结果注：S表示敏感；I表示中度敏感；R表示耐药。表3半数致死量测定试验结果具体实施方式为了使本专利技术的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。蜡样芽孢杆菌HB-SS-1株的分离纯化和鉴定。培养基配制TSA固体培养基配制：准确称取TSA粉末40g，溶于940mL蒸馏水，充分摇匀后121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却至50-60℃时，加入过滤除菌的羊血清60mL，混合均匀后倒板备用；TSB液体培养基配制：准确称取TSB粉末30g，溶于940mL蒸馏水，充分摇匀后121℃高压蒸汽灭菌15min，临用前加入过滤除菌的羊血清60mL即可；分离纯化选取发病麋鹿的肺、胸水、心包液、关节液接种TSA/NAD固体培养基，置37℃、5％CO2条件下培养24-48小时，挑取乳白色的圆形光滑小菌落涂片见图.1，革兰氏染色镜检，选取革兰氏阳性小杆状菌见图.2，再进行两次TSA/NAD固体培养基亚克隆培养。同时接种鲜血琼脂固体培养基和普通琼脂固体培养基，结果TSA/NAD固体培养基上生长速度和形态更为良好。生化鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》，将分离菌株进行生化试验，观察形态特征和生化反应特性，测定生化指标。分离菌株的生化特性符合蜡样芽孢杆菌特有特征见表1，判定为蜡样芽孢杆菌属。16SrDNA基因序列测定与分析将菌株接种至普通营养肉汤培养基中培养过夜(37℃)，离心收集菌体，按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取细菌总DNA。16SrRNA基因PCR扩增引物分别为：P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，P2：5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。菌体DNA模板的制备取培养物1.5mL，10000r/min离心5min，弃上清，沉淀用200μL双蒸水重悬，100℃水浴10min后，12000r/min离心5min收集上清，即为PCR模板，-20℃保存备用。PCR扩增及测序用提取的菌体DNA作为PCR模板。PCR扩增体系为：10×PCRBuffer10μL，MgCl2(25mM)2.5μL，dNTP(2.5mM)4.0μL，引物P1(20μM)2.0μL，引物P2(20μM)2.0μL，模板DNA5.0μL，Taq酶(5U/μL)2.5μL加双蒸水至50μL。反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性2min，53℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，72℃终延伸7min。取10μLPCR扩增产物，用1％的琼脂糖凝胶在120V电压下电泳鉴定，同时以标准株作为阳性对照，结果出现了1000bp大小的特异性条带，经过回收鉴定为阳性的PCR扩增产物交由上海生工生物工程有限公司测序。HB-SS-1株16SrDNA基因测序结果见图.3所示，该序列与GenBank中公布的序列进行BLAST比对，与国内外已有的蜡样芽孢杆菌相应序列的同源性达99％以上。蜡样芽孢杆菌药敏试验用灭菌接种环挑取纯化好的菌落到含有TSB的试管中，37℃摇床培养8h；使用灭菌棉试子蘸取培养好的菌液，在15min内均勾涂布于整个TSA平板表面；将接种好的TSA平板置室温干燥5min；然后采用药敏纸片法，用无菌镊子将19种抗生素纸片贴在含菌琼脂表面，每个TSA平板贴种抗生素纸片，纸片贴好后室温放置15min，再将平板倒置于恒温箱，于37℃培养24h；观察结果，并测量抑菌圈直径，根据CLSI2009年药敏判定标准对结果进行数据分析表见表2，检测分离菌株的药物敏感性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型致病性蜡样芽孢杆菌HB‑SS‑1，其特征在于，所述菌株于2016年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2016672。

【技术特征摘要】
1.一种新型致病性蜡样芽孢杆菌HB-SS-1，其特征在于，所述菌株于2016年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M2016672。2.如权利要求1所述的一种新型致病性蜡样芽孢杆菌HB-SS-1，其特征在于，所述HB-SS-1的16SrDNA序列如SEQIDNO：1所示。3.如权利要求1所述的一种新型致病性蜡样芽孢杆菌HB-SS-1的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、培养基配制TSA固体培养基配制：准确称取TSA粉末40g，溶于940mL蒸馏水，充分摇匀后121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却至50-60℃时，加入过滤除菌的羊血清60mL，混合均匀后倒板备用；TSB液体培养基配制：准确称取TSB粉末...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭锐，田永祥，周丹娜，杨克礼，段正赢，刘泽文，袁芳艳，刘威，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42