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一种利用芽孢杆菌HS17发酵生产胶原蛋白酶的方法及其应用技术

技术编号:15514479 阅读:218 留言:0更新日期:2017-06-04 06:18
本发明专利技术公开了一种利用芽孢杆菌HS17发酵生产胶原蛋白酶的方法及其应用,属于生物技术领域。本发明专利技术利用如下发酵培养基:2~4 g/L明胶,40~50 g/L果糖,3~6 g/L酵母浸粉,3~5 g/L ZnSO

【技术实现步骤摘要】
一种利用芽孢杆菌HS17发酵生产胶原蛋白酶的方法及其应用
本专利技术涉及一种利用芽孢杆菌HS17发酵生产胶原蛋白酶的方法,及其在胶原蛋白多肽制备中的应用,属于生物

技术介绍
胶原蛋白具有独特的超螺旋结构(3条α肽链的右手螺旋),性质稳定,一般加工温度及短时间加热都不能使其分解,不易被人体吸收利用。而将胶原蛋白水解为胶原多肽,具有易吸收、抗溃疡、抗过敏、降血压、抗菌、抗氧化、降胆固醇、抗衰老、促进伤口愈合、预防骨质疏松及关节炎、促进角膜上皮损伤修复等多种生理活性,使得胶原多肽成为水产加工副产物高值化利用的研究热点。胶原蛋白酶是一种水解天然胶原的蛋白水解酶,能在生理pH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构,而不损伤其它蛋白质和组织。胶原蛋白酶的降解活力、稳定性等因素成为高效利用胶原蛋白关键。微生物源胶原蛋白酶是某些微生物在特定环境下分泌的具有降解胶原能力的蛋白酶类,微生物来源的胶原蛋白酶主要是细菌胶原酶,目前研究最多的微生物胶原蛋白酶来源为溶组织梭状芽孢杆菌(Clostridiumhistolyticum),但其为病原菌,伴有毒素产生,并非理想的胶原酶来源。基于目前水产加工企业产生大量鱼皮下脚料的现状,本专利技术是在获得一株促进海马健康养殖的芽孢杆菌(专利技术专利CN104232541A)的基础上,该菌株为益生菌,经培养特性研究发现该菌株也高产胶原蛋白酶,确定其产胶原蛋白酶的培养方法,并以此转化底物胶原蛋白生产胶原蛋白多肽,实现鱼皮等下脚料的高值化利用。
技术实现思路
本专利技术针对上述技术存在的不足,提供一种利用芽孢杆菌HS17发酵生产高活性胶原蛋白酶的培养方法及其应用,以解淀粉芽孢杆菌HS17为出发菌株,经液体发酵的方法生产胶原蛋白酶,该酶可通过高效水解胶原蛋白来生产胶原蛋白多肽。本专利技术所用的菌株为解淀粉芽孢杆菌HS17,其在添加明胶的培养平板上能产生较大的降解圈(附图1),具有高产胶原蛋白酶的,其保藏名称为:HS17,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日期:2014年8月20日,保藏号为CGMCCNo.9532,分类命名:解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。本专利技术是通过如下技术方案来实现的:1.菌种活化取试管斜面保存的菌种转接活化培养基中,于37℃、200rpm下活化18~24h至菌体混浊,制得活化种子液;所用的活化培养基:种子培养基:5g/L葡萄糖,4g/L牛肉膏,1g/L明胶,3g/LNaCl,1g/LK2HPO4,0.4g/LMgSO4,0.2g/LMnSO4,pH7.2。2.摇瓶培养发酵生产胶原蛋白酶采用优选发酵培养基:2~4g/L明胶,40~50g/L果糖,3~6g/L酵母浸粉,3~5g/LZnSO4,3~4g/LMnSO4,2~4g/LFePO4.2H2O,5~6g/L(NH4)2SO4,3~5g/LNa2HPO4,4~6g/LK2HPO4,初始pH6~7,每500mL三角烧瓶中分装50~100mL发酵培养基,115℃灭菌20min。按照3~6%(v/v)的接种量接入活化的种子活化液,后入200rpm的旋转摇床中培养,控制温度为温度30~33℃,发酵36~48h后培养完毕,测定胶原蛋白酶活力。发酵液经8000r/min离心6min,去除菌体后收集保留上清液,然后再经0.22um的微孔过滤膜过滤除菌,即作为液体酶使用。3.发酵罐培养发酵生产胶原蛋白酶以70%比例装入发酵培养组分,经118℃蒸汽灭菌20min后,火焰圈保护条件下按照3~6%(v/v)的比例接入活化的菌种,通过调节酸碱蠕动泵控制发酵过程中的pH始终维持在pH6~7,利用发酵罐的加热装置调节培养温度在30~33℃,溶解氧参数通过调节进罐的无菌空气量和搅拌转速的大小使其始终维持在6%以上。经发酵30~42h后发酵完毕,测定胶原蛋白酶活力。发酵液经8000r/min离心6min,去除菌体后收集保留上清液,然后再经0.22um的微孔过滤膜过滤除菌,即作为液体酶使用。所用的优化培养基:2~4g/L明胶,40~50g/L果糖,3~6g/L酵母浸粉,3~5g/LZnSO4,3~4g/LMnSO4,2~4g/LFePO4.2H2O,5~6g/L(NH4)2SO4,3~5g/LNa2HPO4,4~6g/LK2HPO4。4.胶原蛋白多肽的制备一定量的鳕鱼皮胶原蛋白粉,按照1:5的比例加入磷酸缓冲液(pH7.2)中,然后加入胶原蛋白酶液(底物与酶量比为2:1),在35℃条件下缓慢振摇反应10~20h后终止反应。胶原蛋白水解液经90℃加热灭酶10min,经10000r/min离心8min去除蛋白沉淀,在-75℃下冷冻干燥获得胶原蛋白多肽粉。所用的胶原蛋白酶活力测定方法:1mg的鱼鳞胶原蛋白用0.5mL磷酸缓冲液溶解(pH7.4),加入0.1ml稀释酶液,37℃反应40min。加0.5mL三氯乙酸(10%,m/v)终止反应,再加入0.9mL乙酸缓冲液(pH5.4)和1mL茚三酮显色液混匀。100℃下水浴加热10min,冷却后用3mL的60%%乙醇稀释,在570nm下比色测定。所用的酶活力测定的对照组处理:为消除干扰,首先取0.1mL的稀释酶液在100℃下水浴煮沸10min将酶进行灭活,其余步骤同酶活力测定。所用的酶活力计算方法:在37℃条件下以每mL酶液水解胶原蛋白每min生成1ug的甘氨酸的量为一个酶活力单位(U)。所用的相对酶活力计算方法:每组中的样品酶活力/每组中的最大样品酶活力×100%。本专利技术的有益效果在于:(1)本专利技术所用的芽孢杆菌HS17是来自海马肠道的内生解淀粉芽孢杆菌,非致病菌,生产的胶原蛋白酶安全性高。(2)培养方法切合实际,发酵条件易操作,产酶量高采用本专利技术的培养方法,发酵生产的胶原蛋白酶活力值,与初期的培养方法比较,其酶产量提高了20多倍,培养方法的产量突出。(3)利用该菌株所产胶原蛋白酶对胶原蛋白的水解效率高,用于胶原蛋白多肽的生产将具有广阔的应用前景。附图说明图1为芽孢杆菌HS17平板培养的明胶降解圈;图2为芽孢杆菌HS17在发酵罐中培养曲线;图3为酶解液的薄层层析定性分析,其中标号1为胶原蛋白,标号2为酶解液产物。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术做进一步详细描述,这些实施例用于理解而不是限制本专利技术的保护范围。实施例1:发酵生产胶原蛋白酶的培养基的单因素优化(1)菌种活化:取试管斜面保存的菌种转接活化培养基中,于37℃、200rpm下活化18~24h至菌体混浊,制得活化种子液;所用的活化培养基:种子培养基:5g/L葡萄糖,4g/L牛肉膏,1g/L明胶,3g/LNaCl,1g/LK2HPO4,0.4g/LMgSO4,0.2g/LMnSO4,pH7.2。(2)发酵优化:活化种子液按照5%(v/v)接种量接入不同的发酵培养基后,在30℃、200rpm的摇床中发酵48h后测定胶原蛋白酶活力。碳源对菌株HS17产胶原蛋白酶的影响见表1,可以看出果糖作为碳源发酵生产胶原蛋白酶的效果最好,其次是葡萄糖和糊精。所用的发酵培养基(g/L):碳源20(其种类见表1),蛋白胨8,明胶5,Na2HPO42,K2HPO43,pH7.5。表1碳源对菌株产胶原蛋白酶的影响氮本文档来自技高网...
一种利用芽孢杆菌HS17发酵生产胶原蛋白酶的方法及其应用

【技术保护点】
一种利用芽孢杆菌HS17发酵生产胶原蛋白酶的方法及其应用,其特征在于其包括如下步骤:(1)菌种活化:试管斜面保存的菌种转接活化培养基中,于37℃、200 rpm下活化18~24h至菌体混浊,制得活化种子液;所用的活化培养基:种子培养基:5 g/L葡萄糖,4 g/L牛肉膏,1 g/L明胶,3 g/L NaCl,1 g/L K

【技术特征摘要】
1.一种利用芽孢杆菌HS17发酵生产胶原蛋白酶的方法及其应用,其特征在于其包括如下步骤:(1)菌种活化:试管斜面保存的菌种转接活化培养基中,于37℃、200rpm下活化18~24h至菌体混浊,制得活化种子液;所用的活化培养基:种子培养基:5g/L葡萄糖,4g/L牛肉膏,1g/L明胶,3g/LNaCl,1g/LK2HPO4,0.4g/LMgSO4,0.2g/LMnSO4,pH7.2;(2)发酵生产:按照3~6%(v/v)的接种量将活化种子液接入发酵培养基中,在200rpm的旋转摇床中培养,控制温度在30~33℃,发酵36~48h后培养完毕;或者在发酵罐中以70%比例装入发酵培养组分,经118℃蒸汽灭菌20min后,在火焰圈保护条件下按照3...

【专利技术属性】
技术研发人员:程仕伟韦术敏孙虎山王艳杰李加文李海东
申请(专利权)人:鲁东大学
类型:发明
国别省市:山东,37

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