一株蜡样芽孢杆菌NJSZ-13及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株杀松材线虫的蜡样芽孢杆菌，其分类命名为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）NJSZ‑13，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2016660，保藏日期为2016年11月20日，保藏地址为中国武汉武汉大学。本发明专利技术从松树体内分离的蜡样芽孢杆菌NJSZ‑13具有较好的竞争能力和定殖能力，该蜡样芽孢杆菌NJSZ‑13的无菌发酵液和菌体水悬液对松材线虫都有较强的杀线活性。经试验，在处理36h后，无菌发酵液对松材线虫的致死率能达到100%，并且可以消解线虫虫体，而在处理48h后，菌体水悬液对松材线虫的致死率能达到86.5%，具有很好的实用性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物
，具体涉及一株蜡样芽孢杆菌NJSZ-13及其应用。
技术介绍
松材线虫病(Bursaphelenchusxylophilus)又称松树萎蔫病，是松树的一种毁灭性流行病害，在我国松墨天牛(MonochamusAlternatusHope)是其主要的传播媒介。该病已在中国、日本、韩国、墨西哥等国造成了巨大经济损失，成为世界上许多国家最重要的病虫害检疫对象。目前，对松材线虫病还没有特别有效的防治措施，主要还是采取传统的化学防治。但由于化学药物存在很多弊端(持效性差、易产生抗药性、污染环境及破坏生态平衡等)，其应用正在受到越来越多的限制。所以生物防治正日益受到各国的重视。近年来，从不同来源的生物中，寻找对松材线虫具有较高杀线活性的杀线剂已成为松材线虫病生物防治研究的热点，其中研究最多的是有杀线活性的生防微生物。至今已发现了大量具有杀线活性的生防微生物，主要包括捕食线虫真菌、内寄生真菌、产毒真菌以及能分泌杀线物质的细菌和放线菌等。由于细菌的培养简便、生长繁殖快等特点，使生防细菌在生防微生物的研究中占有重要的地位。现已发现了多种对植物寄生线虫有较高毒效作用的细菌，研究较多的有苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、巴氏杆菌(Pasteuriapenetrans)、假单胞菌(Pseudomonasspp.)及其他一些土壤细菌等，但是上述生防细菌主要用于根结线虫的防治，尚没有用于松材线虫防治的商品化生防细菌的报道。由于松材线虫病是发生在松树上，筛选的杀线细菌将在松林中应用，杀线细菌能否在松林中良好的定殖，对其防治效果会有很大的影响。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一株蜡样芽孢杆菌NJSZ-13，满足杀松材线虫的使用。本专利技术的另一目的是提供一种上述蜡样芽孢杆菌NJSZ-13的应用。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一株杀松材线虫的蜡样芽孢杆菌，其分类命名为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)NJSZ-13，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2016660，保藏日期为2016年11月20日，保藏地址为中国武汉武汉大学。所述的蜡样芽孢杆菌NJSZ-13在杀松材线虫中的应用。所述的蜡样芽孢杆菌NJSZ-13的菌悬液在杀松材线虫中的应用。所述的应用，保存于牛肉膏蛋白胨培养基上的蜡样芽孢杆菌NJSZ-13接入含牛肉膏蛋白胨液体培养基50mL的三角瓶中，于28℃和无光照条件下以200r/min转速摇培；将摇培4d后的细菌培养液用滤膜孔径为0.22μm的细菌过滤器将菌体过滤后，所得的滤液为无菌发酵滤液；将以上过滤器的滤膜放入装有50mLPBS缓冲液的三角瓶中常温震荡十分钟，取出滤膜后所剩液体为菌悬液。其中，菌悬液的浓度为105cfu/mL。所述的蜡样芽孢杆菌NJSZ-13的无菌发酵液在杀松材线虫中的应用。所述的应用，保存于牛肉膏蛋白胨培养基上的蜡样芽孢杆菌NJSZ-13接入含牛肉膏蛋白胨液体培养基50mL的三角瓶中，于28℃和无光照条件下以200r/min转速摇培；将摇培4d后的细菌培养液用滤膜孔径为0.22μm的细菌过滤器将菌体过滤后，所得的滤液为无菌发酵滤液。细菌的筛选：从南京中山陵、上海辰山植物园、洛阳隋唐植物园的黑松、马尾松、湿地松和火炬松茎部共分离到细菌菌株137株，对137株细菌进行杀线活性的测定。从中筛选出一株无菌发酵滤液和菌体水悬液都对松材线虫有毒杀作用的细菌NJSZ-13。NJSZ-13的鉴定：菌株NJSZ-13在牛肉膏蛋白胨固体培养基(NA)上培养48h，菌落呈圆形，稍微隆起，颜色为淡乳白色，不透明，表面较粗糙，蜡油状，边缘有细波状。细胞呈杆状，革兰氏染色阳性，大小为(1.0～1.1)μm×(2.6～5.0)μm，芽孢卵圆形，中生或近中生，两端钝圆，链状排列，有鞭毛，具运动性。革兰氏染色阳性，氧化酶反应阴性，接触酶反应阳性，明胶水解阳性，淀粉水解阳性，甲基红试验阴性，V-P反应阳性。在Biolog鉴定板上培养16～24h后，测得NJSZ-13为Bacilluscereus/Bacillusthuringiensis，SIM值为0.802。将NJSZ-13的16SrDNA序列(SEQIDNO.1所示)与GenBank中的序列进行BLAST比对与NJSZ-13菌株相似性最高的是Bacilluscereus，同源性达到99％。将比对获得的同源序列和测定序列运用ClustalX软件进行多重序列的同源性分析，然后利用MEGA6.05软件构建系统进化树。由构建的系统进化树可以看出，NJSZ-13与Bacilluscereus同属一个遗传分枝。最终确定菌株NJSZ-13为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)，命名为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)NJSZ-13。有益效果：与现有技术相比，本专利技术从松树体内分离的蜡样芽孢杆菌NJSZ-13具有较好的竞争能力和定殖能力，该蜡样芽孢杆菌NJSZ-13的无菌发酵液和菌体水悬液对松材线虫都有较强的杀线活性。经试验，在处理36h后，无菌发酵液对松材线虫的致死率能达到100％，并且可以消解线虫虫体，而在处理48h后，菌体水悬液对松材线虫的致死率能达到86.5％，具有很好的实用性。附图说明图1是蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌体水悬液对松材线虫的致死作用结果图；图2是蜡样芽孢杆菌NJSZ-13无菌发酵液对松材线虫的毒杀作用结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例11)供试线虫的培养和线虫悬浮液的制备供试松材线虫由南京林业大学江苏省有害生物入侵预防与控制重点实验室提供，分离于江苏省连云港地区发病的黑松上。松材线虫采用灰葡萄孢(Botrytiscinerca)培养，将线虫接种在长满灰葡萄孢的PDA平板上，放置于25℃培养箱培养至灰葡萄孢菌丝消失，线虫长满平板。采用贝尔曼漏斗法分离收集线虫，然后离心消毒浓缩配制成约20条/μL的线虫悬液。2)NJSZ-13的无菌发酵滤液和菌体水悬液的制备保存于牛肉膏蛋白胨(NA)培养基上的蜡样芽孢杆菌NJSZ-13接入含牛肉膏蛋白胨液体培养基50mL的三角瓶中，于28℃和无光照条件下以200r/min转速摇培。将摇培4d后的细菌培养液用滤膜孔径为0.22μm的细菌过滤器将菌体过滤后，所得的滤液为试验中的无菌发酵滤液。将以上过滤器的滤膜放入装有50mLPBS缓冲液的三角瓶中常温震荡十分钟，取出滤膜后所剩液体为含细菌菌体的水悬液，用分光光度计调整其浓度为105cfu/mL，即为供试菌体水悬液。3)蜡样芽孢杆菌NJSZ-13无菌发酵滤液杀线活性的测定取以上无菌发酵滤液1mL加入1.5mL的离心管中，接着加入50μL线虫悬液约1000条线虫，混合。分别于处理12h、24h和36h后吸取混合液50μL约50条线虫在体视显微镜下观察线虫死亡情况以及虫体的消解情况，计算线虫的死亡率和消解率。每处理重复三次，以不接菌的NA液体培养基和清水为对照。线虫死亡标准是虫体僵直，用解剖针搅动或接触刺激时仍不活动，如图1和图2所示。表1蜡样芽孢杆菌NJ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株杀松材线虫的蜡样芽孢杆菌，其分类命名为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）NJSZ‑13，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2016660，保藏日期为2016年11月20日，保藏地址为中国武汉武汉大学。

【技术特征摘要】
1.一株杀松材线虫的蜡样芽孢杆菌，其分类命名为蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）NJSZ-13，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2016660，保藏日期为2016年11月20日，保藏地址为中国武汉武汉大学。2.权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌NJSZ-13在杀松材线虫中的应用。3.权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌NJSZ-13的菌悬液在杀松材线虫中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：保存于牛肉膏蛋白胨培养基上的蜡样芽孢杆菌NJSZ-13接入含牛肉膏蛋白胨液体培养基50mL的三角瓶中，于28℃和无光照条件下以200r/min转速摇培；将摇培4d后的细菌培养液用滤膜孔径为0.2...

【专利技术属性】
技术研发人员：谈家金，李亮亮，陈凤毛，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32