具有广谱活性的杀昆虫多肽以及其用途制造技术

本发明专利技术提供从苏云金芽孢杆菌菌株获得的编码具有对昆虫害虫(包括鳞翅目和鞘翅目昆虫)的杀虫活性的多肽的核酸及其变体和片段。本发明专利技术的具体实施方案提供编码杀虫蛋白的分离的核酸、包含本发明专利技术实施方案的核酸的杀虫组合物、DNA构建体以及转化的微生物和植物。这些组合物在用于防治害虫特别是植物害虫的方法中使用。

Insect killing polypeptide having broad spectrum activity and use thereof

The present invention provides nucleic acids obtained from Bacillus thuringiensis strains that encode polypeptides having insecticidal activity against insect pests (including Lepidoptera and Coleoptera insects), and variants and fragments thereof. A specific embodiment of the present invention provides an isolated nucleic acid encoding a pesticidal protein, an insecticidal composition containing the nucleic acid of the present embodiment of the invention, a DNA construct, and transformed microorganisms and plants. These compositions are used in methods for controlling pests, especially plant pests.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有广谱活性的杀昆虫多肽以及其用途以电子方式提交的序列表的引用创建于2015年8月19日、大小为24千字节的文件名为“4803WOPCT_Sequence_Listing”的序列表以计算机可读形式与本说明书同时提交。该序列表是本说明书的一部分，并且全文以引用的方式并入本文。
本公开涉及从新型苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)基因获得的天然和重组核酸，该新型苏云金芽孢杆菌基因编码以针对昆虫害虫的杀虫活性为特征的杀虫多肽。本专利技术的组合物和方法利用所公开的核酸及其编码的杀虫多肽来防治植物害虫。
技术介绍
昆虫害虫是造成全世界农作物损失的主要因素。例如，行军虫取食、小地老虎损害或者欧洲玉米螟损害可对农业生产商造成经济上的破坏。单单是欧洲玉米螟侵袭非甜质玉米和甜玉米造成的昆虫害虫相关作物损失，一年的损害和防治费用就达大约十亿美元。传统上，影响昆虫害虫群体的主要方法是施用广谱化学杀昆虫剂。但是，消费者和政府监管者都日益关注与合成化学杀虫剂的生产和使用相关的环境危害。由于这些关注，监管者禁止或者限制了一些危害比较大的杀虫剂的使用。因此，人们对于开发另类杀虫剂有很大的兴趣。使用微生物剂诸如真菌、细菌或者另一物种的昆虫对具有农业意义的昆虫害虫进行生物防治，提供具有环境友好性和商业吸引力的合成化学杀虫剂替代方案。一般来讲，生物杀虫剂的使用造成的污染和环境危害的风险较低，并且生物杀虫剂能提供比传统广谱化学杀昆虫剂的特征性靶标特异性更高的靶标特异性。另外，生物杀虫剂的生产成本往往较低，因此能提高众多作物的经济收率。已知芽孢杆菌属(Bacillus)微生物的某些物种对于多种昆虫害虫具有杀虫活性，这些昆虫害虫包括鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)等等。苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)(Bt)和日本金龟芽孢杆菌(Bacilluspapilliae)是至今为止发现的最成功的生物防治剂的代表。幼虫芽孢杆菌(B.larvae)、缓病芽孢杆菌(B.lentimorbus)、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)的菌株(Harwook编辑，(1989)，Bacillus(普莱南出版社(PlenumPress))，306)和蜡状芽孢杆菌(B.cereus)的菌株(WO96/10083)也被指出具有昆虫病原性。杀虫活性看起来集中在伴胞晶体蛋白包涵体中，但从芽孢杆菌的营养生长期也分离到杀虫蛋白。有数种编码这些杀虫蛋白的基因已得到分离和表征(参见例如美国专利5,366,892和5,840,868)。微生物杀昆虫剂特别是那些从芽孢杆菌(Bacillus)菌株获得的微生物杀昆虫剂，在农业上作为害虫化学防治的替代方案已起到重要的作用。最近，农业科学家通过对作物植物进行遗传工程改造以产生来自芽孢杆菌的杀虫蛋白，开发出了抗昆虫性增强的作物植物。例如，已对玉米和棉花植物进行遗传工程改造以产生从Bt的菌株分离的杀虫蛋白(参见例如Aronson(2002)CellMol.LifeSci.59(3)：417-425；Schnepf等人(1998)MicrobiolMolBiolRev.62(3)：775-806)。这些经遗传工程改造的作物目前在美国农业中广泛应用，给农场主提供了替代传统昆虫防治方法的环境友好的替代方案。另外，经遗传工程改造而含有杀虫Cry毒素的马铃薯已被出售给美国农场主。虽然这些经遗传工程改造的抗昆虫作物植物已证明在商业上十分成功，但它们仅对较窄范围的经济上重要的昆虫害虫具有抗性。因此，仍然需要对昆虫害虫具有更大范围的杀昆虫活性的新Bt毒素，例如对更多种类的鳞翅目昆虫具有活性的毒素。另外，仍然需要对多种昆虫害虫具有活性的生物杀虫剂并且需要具有改善的杀昆虫活性的生物杀虫剂。
技术实现思路
本专利技术提供用于影响昆虫害虫的组合物和方法。更具体地，本专利技术的实施方案涉及利用编码杀昆虫肽的核苷酸序列来产生能表达本专利技术实施方案的杀昆虫多肽的转化微生物和植物从而影响昆虫的方法。在一些实施方案中，该核苷酸序列编码对至少一种属于鳞翅目的昆虫具有杀虫作用的多肽。本专利技术实施方案提供编码对昆虫害虫具有杀虫活性的多肽的核酸分子以及其片段和变体(例如SEQIDNO：1、或SEQIDNO：3)。获自苏云金芽孢杆菌(Bthuringiensis)的本专利技术实施方案的野生型(例如天然)核苷酸序列编码新型杀昆虫肽。本专利技术实施方案还提供所公开的核苷酸序列的编码生物活性(例如杀昆虫)多肽的片段和变体。本专利技术实施方案还提供由本专利技术实施方案的天然或经修饰的(例如经诱变或经操纵的)核酸所编码的分离的杀虫(例如杀昆虫)多肽。具体举例，本专利技术实施方案的杀虫蛋白包括从经诱变的核酸产生的全长蛋白质和多肽的片段，该经诱变的核酸被设计用来将特定氨基酸序列引入本专利技术实施方案的多肽中。在特定实施方案中，多肽相对于衍生它们的天然多肽的杀虫活性具有增强的杀虫活性。本专利技术实施方案的核酸也可用于产生转基因的(例如转化的)单子叶植物或双子叶植物，该植物的特征在于其基因组包含至少一个被稳定掺入的核苷酸构建体，该核苷酸构建体包含可操作地连接至驱动所编码的杀虫多肽表达的调控元件的本专利技术实施方案的编码序列。因此，本专利技术还提供转化的植物细胞、植物组织、植物以及它们的种子。在一个特定实施方案中，可使用已被优化以使在宿主植物中的表达提高的核酸来产生转化的植物。例如，可将本专利技术实施方案的杀虫多肽之一进行反翻译，以产生包含为了在特定宿主中表达而优化的密码子的核酸，宿主例如是作物植物诸如玉米(Zeamays)植物。这种转化的植物(例如双子叶植物或者单子叶植物)表达编码序列将导致产生杀虫多肽并向植物赋予提高的抗昆虫性。一些实施方案提供表达在用于影响各种昆虫害虫的方法中使用的杀虫多肽的转基因植物。本专利技术实施方案还包括含有本专利技术实施方案的杀昆虫多肽的杀虫组合物或杀昆虫组合物，并可任选包含另外的杀昆虫肽。本专利技术实施方案涵盖将这种组合物应用于昆虫害虫的环境以影响昆虫害虫。具体实施方式本专利技术的实施方案涉及用于影响昆虫害虫尤其是植物害虫的组合物和方法。更具体地，本专利技术实施方案的分离的核酸以及其片段和变体包含编码杀虫多肽(例如蛋白质)的核苷酸序列。所公开的杀虫蛋白对昆虫害虫具有生物活性(例如杀虫活性)，昆虫害虫诸如但不限于鳞翅目的昆虫害虫。本专利技术实施方案的组合物包含编码杀虫多肽的分离的核酸以及其片段和变体、包含本专利技术实施方案的核苷酸序列的表达盒、分离的杀虫蛋白以及杀虫组合物。一些实施方案提供对鳞翅目的杀昆虫活性相对于对应的野生型蛋白的杀虫活性得到改善的经修饰的杀虫多肽。本专利技术实施方案还提供用这些新型核酸转化的植物和微生物，以及涉及将这种核酸、杀虫组合物、转化的生物体及其产物用于影响昆虫害虫的方法。本专利技术实施方案的核酸和核苷酸序列可用于转化任何生物体以产生所编码的杀虫蛋白。本专利技术提供涉及使用这种转化的生物体来影响或防治植物害虫的方法。本专利技术实施方案的核酸和核苷酸序列也可用于转化细胞器诸如叶绿体(McBride等人，(1995)Biotechnology13：362-365；和Kota等人，(1999)Proc.Na本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子选自：(a)包含选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的核苷酸序列或它们的全长互补序列的核酸分子；(b)编码包含选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽的核酸分子；(c)包含编码如下蛋白质的核苷酸序列的核酸分子，所述蛋白质包含与选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列；以及(d)包含编码如下蛋白质的核苷酸序列的核酸分子，所述蛋白质包含与选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.16 US 62/0647121.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子选自：(a)包含选自SEQIDNO:1和SEQIDNO:3的核苷酸序列或它们的全长互补序列的核酸分子；(b)编码包含选自SEQIDNO:2和SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽的核酸分子；(c)包含编码如下蛋白质的核苷酸序列的核酸分子，所述蛋白质包含与选自SEQIDNO:2和SEQIDNO:4的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列；以及(d)包含编码如下蛋白质的核苷酸序列的核酸分子，所述蛋白质包含与选自SEQIDNO:2和SEQIDNO:4的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列是已被设计用于在植物中表达的合成序列。3.一种DNA构建体，所述DNA构建体包含可操作地连接至异源调控元件的根据权利要求1所述的核酸分子。4.根据权利要求3所述的DNA构建体，所述DNA构建体还包含编码异源多肽的核酸分子。5.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求3所述的DNA构建体。6.根据权利要求5所述的宿主细胞，所述宿主细胞为细菌细胞。7.根据权利要求5所述的宿主细胞，所述宿主细胞为植物细胞。8.一种转基因植物，所述转基因植物包含根据权利要求7所述的宿主细胞。9.根据权利要求8所述的转基因植物，其中所述植物选自玉蜀黍、高粱、小麦、卷心菜、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、糖用甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油菜。10.根据权利要求9所述的植物的转化种子，其中所述种子包含所述DNA构建体。11.一种分离的多肽，所述分离的多肽选自：(a)包含选自SEQIDNO:2和SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽；(b)由选自SEQIDNO:1和SEQIDNO:3的核苷酸序列编码的多肽；(c)与选自SEQIDNO:2和SEQIDNO:4的多肽序列具有至少90％的序列同一性的多肽序列，其中所述多肽具有杀昆虫活性；以及(d)与选自SEQIDNO:2和SEQIDNO:4的多肽序列具有至少95％的序列同一性的多肽序列，其中所述多肽具有杀昆虫活性。12.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求11所述的多肽。13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述组合物选自散剂、粉剂、丸剂、颗粒剂、喷剂、乳剂、胶体剂和溶液剂。14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述组合物通过对苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)细胞的培养物进行干燥、冻干、均化、提取、过滤、离心、沉淀或浓缩而制备。15.根据权利要求13所述的组合物，所述组合物包含1重量...

【专利技术属性】
技术研发人员：AR阿巴德，H董，DM卡普卡基茨曼，SB罗，X施，J王，TC沃菲，L周，
申请(专利权)人：先锋国际良种公司，
类型：发明
国别省市：美国,US