解淀粉芽孢杆菌BN-1及应用制造技术

本发明专利技术涉及植物病害的生物防治，属于植物保护学科中的生物防治研究与应用领域。具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌及应用，该菌株是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BN‑1，它的保藏编号为CGMCC No.13262。该菌株对桃枝枯病菌的抑制效果与化学农药多菌灵相当。因此可以用解淀粉芽孢杆菌BN‑1研发新型生物农药，用于桃枝枯病的生物防治。

【技术实现步骤摘要】
解淀粉芽孢杆菌BN-1及应用
本专利技术涉及植物病害的生物防治，属于植物保护学科中的生物防治研究与应用领域。具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌及应用。
技术介绍
桃枝枯病是近几年我国南方桃产区新出现的重要病害，特别是江苏无锡和浙江嘉兴产区，极易造成新梢枯死、树势衰弱，严重影响桃果产量。目前防治该病的方法主要是利用咪鲜胺、多菌灵和苯醚甲环唑等化学药剂喷施，其他药剂防效不够理想。而这些化学农药的常年和大量使用，病原菌会产生抗药性，并对桃果、环境和人类健康产生不利影响，不符合桃产业的可持续发展。而生物防治的研究及其应用避免了化学农药带来的负面影响，成为目前植物病害综合或生态治理中的重要手段。目前在桃枝枯病防控方面缺乏生物防治手段，从病害防治角度，还需开发其它有效药剂特别是生物菌剂供农业生产选择使用。自然界含有许多有益微生物，从环境中大量筛选得到生防微生物是生物药剂研制的基础工作，也是业内筛选有益微生物的惯用工作模式。生防细菌一般是一类可产生抗菌物质(如抗生素、抗菌蛋白、多肽等)的细菌，以桃枝枯病菌为目标真菌，从土壤或植物根际根围土壤中筛选能抑制该菌的细菌，是一种效率较高的筛选生防微生物的方法。
技术实现思路
本专利技术为了给研制新型生物农药提供基础，丰富防治桃枝枯病的药剂种类，提供一株生防菌株，其能有效抑制桃枝枯病菌(Phomopsisamygdali)生长。本专利技术所述的生防菌是：一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BN-1，它的保藏编号为CGMCCNo.13262。本专利技术进一步公开了解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BN-1在防治桃枝枯病菌中的应用。该菌株对桃枝枯病菌的抑制效果与化学农药多菌灵相当。可弥补桃枝枯病防控中缺乏的生物防治手段，该菌可部分替代化学农药或与化学农药交替使用，在不影响防效的情况下能明显减少化学农药使用，减少农药残留和对环境造成的污染，同时也可延缓病菌产生抗药性，有助于保证桃果的安全性，提升水蜜桃优质果品率和质量。因此可以用解淀粉芽孢杆菌BN-1研发新型生物农药，用于桃枝枯病的生物防治。另外用该菌株生物防治还可辐射到浙江、上海等桃枝枯病发生严重的桃产区。因此，该专利技术及其应用，不仅能够防治病害减少经济损失，而且还能推动桃产业的绿色可持续发展，减少农药对环境造成的污染。本专利技术解淀粉芽孢杆菌BN-1能有效抑制桃枝枯病菌，效果与化学农药多菌灵相当，有防治桃枝枯病的潜力。该菌株产生的抑菌活性物质主要是脂肽类抗生素，对桃枝枯病菌产生抑制作用。与化学药剂相比，使用BN-1菌株防治植物病害没有环境污染、农药残留等问题。附图说明图1是解淀粉芽孢杆菌BN-1菌株对桃枝枯病菌的拮抗效果。图2是从BN-1菌株发酵液提取的脂肽抗生素粗提物对桃枝枯病菌的拮抗效果。图3是BN-1菌株的菌落形态。图4是BN-1菌株16SrDNA序列PCR扩增电泳图。图5是BN-1菌株脂肽抗生素合成相关基因PCR扩增电泳图。本专利技术所述菌株BN-1于2016年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名为解淀粉芽孢杆菌，拉丁名为：Bacillusamyloliquefaciens，保藏编号为CGMCCNo.13262。具体实施方式(1)采集桃根际土样(3～10cm耕作层)，去除石子等大颗粒物质，碾碎均匀，风干后过筛(40目)。(2)10g土样放置于含100mL无菌水的三角瓶中，强烈充分振荡5min，然后静置5min；以上层悬浮液为母液，进行10倍系列梯度稀释。(3)取10-5、10-6稀释液0.1mL均匀涂布牛肉浸膏蛋白胨(NA)平板。(4)30℃条件下培养4天。(5)分离不同性状、颜色的单菌落，再NA平板划线纯化后保存。(6)将桃枝枯病菌(菌株由本实验室从无锡阳山桃园病枝上分离获得，经形态、致病性测测和分子生物学鉴定为桃枝枯病菌)菌丝块(直径6mm)接在马铃薯蔗糖琼脂培养基(PDA)平板中央，将分离出的待测细菌菌株分别接种到离病原菌月20mm的对称位置，每个平板接种4个待测菌株。30℃培养48h观察抑菌活性。根据抑菌带的有无确定待测菌株的拮抗活性。(7)对初筛有拮抗活性的菌株进行复筛，方法同(6)，只是在每个平板上只验证一株拮抗菌，两侧接种。同时连续转接多代后按上述方法再测菌株的拮抗性，确定拮抗稳定性。获得一株拮抗性强且稳定的菌株，命名为BN-1。如图1，平板中靠近接种BN-1菌落的病菌菌丝生长受到了抑制，形成可明显的抑菌带，说明BN-1菌株发酵过程中能产生抑菌物质，使附近的病菌不能生长。(8)采用形态特征和生理生化特征和16SrRNA基因序列分析进行菌株种类鉴定。形态和培养特征：革兰氏染色阳性，杆状，有芽孢；菌落在平板上呈白色至淡黄色，不透明，蜡质，平铺，表面粗糙中央有隆起皱褶，边缘不规则，不产生色素(图3)；液体培养静止时，前期有颗粒沉淀，后期除沉淀外，液面产生菌膜。生理生化特征：菌株的生理生化特征见表1。表1菌株BN-1的生理生化特征注：+，阳性；－，阴性。以上特征与解淀粉芽孢杆菌一致。16SrRNA基因序列分析：提取BN-1基因组DNA，采用细菌16SrRNA基因通用引物扩增，扩增出一条特异性条带，大小约1200bp(图4)。将目的条带回收、测序，将获得的序列在GenBank中进行BLAST比对，结果表明菌株BN-1的16SrRNA基因序列与解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的序列相似性高达99.％。因此，BN-1菌株为解淀粉芽孢杆菌。BN-1菌株的16SrRNA基因序列如SEQIDNO.1所示。(9)BN-1产生脂肽类抗生素分析及活性脂肽抗生素合成相关基因序列分析：利用分子生物学手段对BN-1基因组中脂肽类抗生素合成相关基因进行检测，以明确BN-1是否具有代谢产生脂肽抗生素的可能性。利用特定菌株的特定基因序列设计出四对引物，分别对mycB基因(抗霉枯草菌素mycosubtilin操纵元中的基因)、fenB基因(丰原素fengycin合成酶基因)、ituA基因(伊枯草菌素iturinA合成酶基因)和sfp基因(sfp基因编码4'-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶，是非核糖体途径合成脂肽类化合物的关键基因，该基因通常与表面活性素surfactin合成酶基因srf相邻，是表面活性素产生的必须基因，通常认为含有sfp基因的芽孢杆菌菌株能够代谢产生表面活性素)进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，均能在指定位置出现一条特异性条带(图5)。将凝胶条带回收纯化后进行测序，所测序列进行BALST分析，结果表明测序序列分别与mycB、fenB、ituA和sfp基因的相似性为98％、99％、98％和99％。扩增比对结果见表2。根据分析结果推测解淀粉芽孢杆菌BN-1基因组中存在伊枯草菌素家族成员抗霉枯草菌素、伊枯草菌素A合成相关基因，丰原素合成相关基因和表面活性素合成相关基因，该菌株可能代谢产生这几类脂肽抗生素。表2菌株BN-1脂肽类抗生素合成相关基因扩增比对结果脂肽类抗生素粗提液制备和活性：BN-1发酵液4800r/min离心30min，收集上清液；加入7mol本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BN‑1，它的保藏编号为CGMCC No.13262。

【技术特征摘要】
1.一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BN-1，它的保藏编号为CGMCCNo.1326...

【专利技术属性】
技术研发人员：纪兆林，黄沈鑫，徐敬友，董京萍，金唯新，宋宏峰，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32