一种解淀粉芽孢杆菌高密度发酵方法及其菌剂制备方法技术

本发明专利技术提供一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的高密度发酵方法及其菌剂制备方法。高密度发酵培养基含有麸皮或葡萄糖、豆粕或酵母膏、NaCl、MgSO

【技术实现步骤摘要】
一种解淀粉芽孢杆菌高密度发酵方法及其菌剂制备方法
本专利技术涉及一种微生物发酵
，具体涉及具体涉及一种具有生防功能的解淀粉芽孢杆菌高密度发酵方法及其干粉菌剂制备方法。
技术介绍
植物病害不仅降低作物产量与品质，造成直接经济损失，而且这些植物病害会产生有毒物质，对人畜健康造成威胁，严重制约农业的可持续发展。目前植物病害防治主要以抗病品种与化学防治为主，然而抗病品种的筛选周期长且难度大，而化学防治易造成环境与食品污染，随着人类对环境和食品安全质量的要求愈来愈高，化学防治亦愈来愈不受欢迎。绿色、无污染对人畜无害的生物防治成为近年来研究植物病害防治的热点，其中拮抗细菌在生物防治中发挥着重要作用。目前在拮抗细菌中研究最多的是芽孢杆菌，芽孢杆菌是植物与土壤中的优势微生物种群，大多数为非致病菌，且许多优良菌株对多种植物土传病害具有拮抗作用。芽孢杆菌本身具有种类繁多、抗逆性强、繁殖速度快、易定植于植物根际表面等优点。解淀粉芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，解淀粉芽孢杆菌能够分泌抗菌蛋白、抗生素、酶或多肽等活性物质，对植物病原原菌、真菌、病毒、线虫有很好的抑制作用，显著提高植物的抗病性，同时能促进植物生长，提高植物的产量，是一种很好的生防促生菌。目前生防解淀粉芽孢杆菌在瓜果蔬菜等经济作物的枯萎病、灰霉病、疫霉病、炭疽病、青枯病等植物病害均具有显著的防效。活菌数与芽孢得率是衡量解淀粉芽孢杆菌菌剂的非常关键指标，但目前国内外对解淀粉芽孢杆菌发酵工艺的研究主要集中在产抗菌脂肽、淀粉酶、蛋白酶等酶类物质，较少进行生防解淀粉芽孢杆菌高密度发酵优化研究，且高密度发酵工艺优化中多数只提高活菌数，而芽孢形成率偏低，芽孢率低将降低菌剂的活性和质量稳定性，因此不适合推广使用，生产成本高。因此，开发一种既具有生防功能，又有高芽孢率的菌剂产品将变得非常有意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于利用廉价碳氮源液体发酵生产生防解淀粉芽孢杆菌菌剂，降低其生产成本，提高单位体积发酵液中的活菌数及芽孢得率，为生防解淀粉芽孢杆菌菌剂的工业化生产以及推广提供参考依据。本专利技术首先提供一种用于发酵解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的发酵培养基，含有以下原料：麸皮或葡萄糖、豆粕或酵母膏、NaCl、MgSO4、CaCO3。优选地，本专利技术的发酵培养基含有以下原料：麸皮10-30g/L、豆粕10-30g/L、NaCl1-4g/L、MgSO40.5-1.5g/L、CaCO30.5-1.5g/L、pH6.0-7.0。更优选地，本专利技术的发酵培养基含有以下原料：麸皮15-25g/L、豆粕15-25g/L、NaCl1-3g/L、MgSO40.8-1.2g/L、CaCO30.8-1.2g/L、pH6.0-7.0。另一方面，本专利技术的发酵培养基含有以下原料：葡萄糖和酵母膏，NaCl1-4g/L、MgSO40.5-1.5g/L、CaCO30.5-1.5g/L；其中，葡萄糖在发酵培养基中的质量百分比为2％，酵母膏在发酵培养基中的质量百分比为1％，pH6.0-7.0。本专利技术提供了上述发酵培养基在发酵解淀粉芽孢杆菌中的应用。本专利技术提供了上述发酵培养基在制备解淀粉芽孢杆菌菌剂中的应用。本专利技术提供一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的高密度发酵方法，是将解淀粉芽孢杆菌活化后的种子液接种于本专利技术上述发酵培养基中，调节温度、压力、通气、搅拌，进行发酵培养。其中，将解淀粉芽孢杆菌活化后的种子液按体积比1％-3％的接种量接入发酵培养基中；0-24h培养条件：温度30±2℃、搅拌速率150-200r/min、通气量20-100m3/h、罐压0.04-0.06Mpa；25h之后的培养条件：温度30±2℃、搅拌速率100-150r/min、通气量10-60m3/h、罐压0.04-0.06Mpa，当发酵液中90％以上菌体形态为芽孢时，停止发酵。本专利技术还提供了一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌剂的制备方法，包括以下步骤：(1)活化解淀粉芽孢杆菌，进行一级、二级种子液制备，将种子液接种于本专利技术上述的发酵培养基中；(2)调节温度、压力、通气、搅拌，进行发酵培养，当发酵液中90％以上菌体形态为芽孢时，停止发酵；(3)将菌剂保护剂加入发酵液中，离心收集菌泥；(4)菌泥喷雾干燥得到菌剂粉剂。步骤(1)中，活化解淀粉芽孢杆菌菌种方法：将解淀粉芽孢杆菌划线接种于营养琼脂培养基平板上进行培养，30-40℃下培养12-28h，然后挑取单菌落划线转接于营养琼脂斜面，30-40℃下培养12-28h后得活化菌种；摇瓶一级种子液制备：在1000-2000mL锥形瓶中装入20-30％的种子培养基，将活化后的菌种接入摇瓶种子培养基中，培养条件：温度30-40℃、摇床转速160-200r/min、培养时间12-16h；种子罐二级种子液制备：将所得的种子液经镜检无杂菌污染后按1-3％的接种量接入二级种子罐中，培养条件：温度30±2℃、搅拌速率150-200r/min、种子罐体积100L、装液量50-70％，通气量2-4m3/h、罐压0.04-0.06Mpa、培养时间12-16h。所述的营养琼脂斜面与营养琼脂平板培养基的组成为：牛肉膏3.0g/L、蛋白胨10g/L、NaCl5g/L、琼脂15-20g/L、pH7.0±0.1。所述的生防解淀粉芽孢杆菌高密度发酵工艺，其中，所述的摇瓶种子培养基组成为：酵母膏10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L、pH7.0±0.1。所述的生防解淀粉芽孢杆菌高密度发酵工艺，其中，所述的二级种子培养基组成为：酵母膏10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L、pH7.0±0.1。上述方法在步骤(2)中，发酵培养时，0-24h培养条件：温度30±2℃、搅拌速率150-200r/min、通气量20-100m3/h、罐压0.04-0.06Mpa；25h之后的培养条件：温度30±2℃、搅拌速率100-150r/min、通气量10-60m3/h、罐压0.04-0.06Mpa；步骤(3)采用碟片式离心机进行离心，转速6000-6600r/min；步骤(4)喷雾干燥方法为：进风温度180-220℃、出风温度、90-110℃、进料变频11-13Hz。步骤(3)所述菌剂保护剂为玉米淀粉，按3％-6％(w/v)的添加量加入发酵液中。上述制备方法制得的解淀粉芽孢杆菌的菌剂也属于本专利技术的保护范围。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术发酵工艺简单，直接以麸皮和豆粕作为培养基碳氮源发酵原料简单易得，成本低，发酵周期短(36h)，易扩大化生产。本专利技术所得菌剂活菌及芽孢率高，芽孢形成率均高于90％，最终干粉制剂中有效活菌数≥9.0×1010cfu/g，室温下，保质期达18个月。本专利技术所述的生防解淀粉芽孢杆菌高密度发酵工艺，除在摇瓶种子培养与高密度发酵培养的培养基成分及比例与现有技术不同外，在发酵培养过程中采用了两步发酵技术，第一步目的为促进菌体快速增长，第二步为促进芽孢的形成，提高芽孢生成率。经试验证实，本专利技术所述的生防解淀粉芽孢杆菌菌剂对辣椒疫霉病有较好的防效，对辣椒疫霉病盆栽试验防效达到52.38％由此可见，该菌剂在开本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于发酵解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的发酵培养基，其特征在于，含有以下原料：麸皮或葡萄糖、豆粕或酵母膏、NaCl、MgSO

【技术特征摘要】
1.一种用于发酵解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的发酵培养基，其特征在于，含有以下原料：麸皮或葡萄糖、豆粕或酵母膏、NaCl、MgSO4、CaCO3。2.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，含有以下原料：麸皮10-30g/L、豆粕10-30g/L、NaCl1-4g/L、MgSO40.5-1.5g/L、CaCO30.5-1.5g/L、pH6.0-7.0。3.如权利要求2所述的发酵培养基，其特征在于，含有以下原料：麸皮15-25g/L、豆粕15-25g/L、NaCl1-3g/L、MgSO40.8-1.2g/L、CaCO30.8-1.2g/L、pH6.0-7.0。4.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，含有以下原料：葡萄糖和酵母膏，NaCl1-4g/L、MgSO40.5-1.5g/L、CaCO30.5-1.5g/L；其中，葡萄糖在发酵培养基中的质量百分比为2％，酵母膏在发酵培养基中的质量百分比为1％，pH6.0-7.0。5.一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的高密度发酵方法，其特征在于，将解淀粉芽孢杆菌活化后的种子液接种于权利要求1-4任一所述的发酵培养基中，调节温度、压力、通气、搅拌，进行发酵培养。6.如权利要求5所述的高密度发酵方法，其特征在于，其特征在于，将解淀粉芽孢杆菌活化后的种子液按体积比1％-3％的接种量接入发酵培养基中；0-24h培养条件：温度30±2℃、搅拌速率150-200r/min、...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑双凤，谭石勇，谭武贵，丰来，罗志威，徐滔明，张冬雪，
申请(专利权)人：湖南泰谷生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43