本发明专利技术公开了一种应用解淀粉芽孢杆菌生产生物表面活性素的方法，属于工业微生物技术领域。本发明专利技术应用筛选得到的解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.12593合成生物表面活性素(surfactin)，产量高达9.43g/L，并且发酵过程具有生物表面活性素合成与菌株生长同步且无延滞期的特点。本发明专利技术提供的菌株及发酵方法将在生物表面活性素的工业生产中发挥重要作用，应用前景广阔。
Method for producing biological surfactant by using Bacillus subtilis
The invention discloses a method for producing biological surfactant by using Bacillus subtilis, belonging to the technical field of industrial microorganism. The invention relates to the use of screened Bacillus amyloliquefaciens CGMCC No.12593 synthesis of surfactin (surfactin), yield up to 9.43g/L, and the fermentation process has the characteristics of surfactin synthesis and synchronous growth lag phase and strain. The strain and the fermentation method provided by the invention will play an important role in the industrial production of the biological surfactant, and the application prospect is broad.
【技术实现步骤摘要】
一种应用解淀粉芽孢杆菌生产生物表面活性素的方法
本专利技术涉及一种应用解淀粉芽孢杆菌生产生物表面活性素的方法，属于工业微生物
技术介绍
生物表面活性素，即surfactin，是枯草芽孢杆菌经非核糖体途径(NRPS)合成的由长链脂肪酸(C12-C17)和含7个氨基酸的多肽经内酯键连接起来的一种环状脂肽，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、溶血栓、降胆固醇的药用功效以及优越的表面活性功能。生物表面活性素的广谱抗菌功效有望弥补现今普遍存在的抗生素耐药性难题，生物表面活性素的抗病毒和抗肿瘤功能也为新型药物设计提供了一些可选方案，而生物表面活性素优越的表面活性功能(能够将水分子的表面张力从72mN/M降低至27mN/M)使其在化妆品，医药，乳化剂，保湿剂和精细化工中有着广泛的应用前景。据统计，2006年世界表面活性剂产业的产值在200亿美元以上，其中北美，西欧和中国占据了70％以上的市场份额。生物表面活性素作为一种优越的生物表面活性剂，显示出广阔的应用价值和市场前景。因此，开发能够高效合成surfactin的微生物菌株及生产工艺对于surfactin的工业化生产和普及有重要意义。目前，生物表面活性素产生菌的选育主要采用诱变育种和随机筛选相结合的方法，虽然诱变菌株的生物表面活性素产量有所提高，但仍由于产率过低、菌株稳定性差而无法应用于工业生产，筛选野生型高产菌株仍然是实现生物表面活性素工业化生产的首要任务。据文献报道，芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌)在菌体生长过程中仅有部分细胞能合成生物表面活性素，继而诱发形成生物菌膜(biofilm)。芽孢杆菌菌膜形成途径被激活后，生物表面活性素的合成受到反馈抑制，继而表面活性素的代谢合成也随之结束。自然界中的芽孢杆菌通过形成生物菌膜以达到应对环境压力，获取竞争优势的目的，因而其生物表面活性素的合成能力都较弱，仅能合成诱导生物膜形成的剂量。此外，生物表面活性素surfactin具有抗生素活性，通过非特异性攻击细胞膜的磷脂双分子层，形成胞浆渗漏，从而达到杀灭微生物的目的。这也是大多数芽孢杆菌不能过量合成surfactin的另一原因。野生型芽孢杆菌的原始产量一般为100-200mg/L，虽然经发酵培养基及发酵条件后，生物表面活性素的产量能达到一定程度的提高，要想继续提高生物表面活性素的产率则需要昂贵的特殊发酵设备，如应用发酵-膜提取偶联反应器，枯草芽孢杆菌的生物表面活性素最高产量约为6.5g/L。昂贵的生产成本是生物表面活性素仍不能商业化生产的主要因素。因此，获得高产生物表面活性素的天然高产菌株，提高生产效率，降低生产成本，仍然是生物表面活性素商业化应用的根本解决途径。
技术实现思路
本专利技术首先提供一株超高效合成生物表面活性素surfactin的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)MT45，该菌株已于2016年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.12593，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。所述的解淀粉芽孢杆菌MT45菌株的菌落形态表现为：菌落圆形、半透明，菌落表面光滑无褶皱、不形成生物菌膜，菌落中央微微凸起，显微镜下细胞呈杆状、形成芽孢，革兰氏染色阳性。本专利技术还提供了一种应用上述解淀粉芽孢杆菌MT45生产生物表面活性素的方法，包括以下步骤：(1)挑取解淀粉芽孢杆菌CGMCCNO.12593纯种菌落，活化得到种子培养液；(2)将步骤(1)得到的种子培养液按照1％-5％的接种量接种于发酵培养基中，并在25-37℃条件下培养30-55h。在本专利技术的一种实施方式中，所述种子培养基配方为葡萄糖2％、酵母粉1％、氯化钠0.5％，自然pH。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基的配方为碳源10-100g/L，氮源1-10g/L，蛋白胨0.1-1.5g/L，磷酸二氢钾2-10g/L，磷酸氢二钠2-10g/L，硫酸镁0-0.2g/L；所述碳源包括蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、壳聚糖、甘油、可溶性淀粉、糊精中的一种或几种；所述氮源包括硝酸铵，硫酸铵，氯化铵，碳酸铵，碳酸氢铵中的一种或几种。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基的碳源为蔗糖、葡萄糖、果糖、或甘油。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基的碳源为葡萄糖或蔗糖。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基的氮源为硝酸铵、碳酸铵或硫酸铵。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基的配方为碳源10-30g/L，氮源2-6g/L，蛋白胨0.1-1.5g/L，磷酸二氢钾2-10g/L，磷酸氢二钠2-10g/L，硫酸镁0-0.2g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基的配方为蔗糖或葡萄糖10-30g/L，硝酸铵或碳酸安或硫酸铵2-6g/L，蛋白胨0.1-1.5g/L，磷酸二氢钾2-10g/L，磷酸氢二钠2-10g/L，硫酸镁0.01-0.2g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基的配方为蔗糖30g/L，硝酸铵6g/L，蛋白胨0.5g/L，磷酸二氢钾2-10g/L，磷酸氢二钠2-10g/L，硫酸镁0.18g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基的配方为蔗糖10g/L，硝酸铵6g/L，蛋白胨1.5g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钠2g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基的配方为蔗糖30g/L，硝酸铵6g/L，蛋白胨0.5g/L，磷酸二氢钾2-10g/L，磷酸氢二钠2-10g/L，硫酸镁0.18g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基的配方为蔗糖10g/L，氮源6g/L，蛋白胨1.5g/L，硫酸锌0.14g/L，磷酸二氢钾4g/L，磷酸氢二钠2g/L，硫酸镁0.18g/L。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)挑取解淀粉芽孢杆菌CGMCCNO.12593纯种菌落，种于种子培养基，在温度37℃，摇床转速为200rpm条件下培养24h得到种子培养液。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供一种新型解淀粉芽孢杆菌MT45菌株，该菌株能够利用无机盐培养基超强合成生物表面活性素。所述菌株生物表面活性素的合成与菌体生长同步，具有产物(surfactin)合成与菌株生长同步且无延滞期，菌株不形成生物菌膜、避免产物反馈抑制，菌株对产物耐受性强的特点。本专利技术提供的培养方法采用优选的碳源和氮源及碳氮源优选的配比，发酵55h能最高合成生产9.43g/L的生物表面活性素、，能够满足工业大规模生产要求，具有巨大的工业应用前景。生物材料保藏解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，已于2016年6月6日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.12593，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。附图说明图1为解淀粉芽孢杆菌MT45在营养琼脂平板上的菌落形态(A)和显微镜图片(B)。图2为基于16srRNA序列比对的解淀粉芽孢杆菌MT45系统进化树。图3为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)MT45(A)和模式微生物枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ATCC6051(B)在发酵培养基中的生长本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，已于2016年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12593，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
【技术特征摘要】
1.一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，已于2016年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.12593，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。2.根据权利要求1所述的一株解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述菌株外在表现为菌落圆形、半透明，菌落表面光滑无褶皱、不形成生物菌膜，菌落中央微微凸起，显微镜下细胞呈杆状、形成芽孢，革兰氏染色阳性；菌株生长与生物表面活性素合成同步，无延滞期；菌株发酵过程中不形成生物菌膜，有利于产物超高效合成。3.一种应用权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌CGMCCNO.12593生产生物表面活性素的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)挑取解淀粉芽孢杆菌CGMCCNO.12593纯种菌落，活化得到种子培养液；(2)将步骤(1)得到的种子培养液按照1％-5％的接种量接种于发酵培养基中，并在25-37℃条件下培养30-55h；所述发酵培养基的配方为碳源10-100g/L，氮源1-10g/L，蛋白胨0.1-1.5g/L，磷酸二氢钾2-10g/L，磷酸氢...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐岩，吴群，郅岩，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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