本发明专利技术涉及功能微生物筛选及应用技术领域，具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌的筛选及其在刺参养殖上的应用。本发明专利技术的一株解淀粉芽孢杆菌，于2015年12月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心；请求保藏人：鲁东大学；保藏编号为CCTCC NO：M2015774，该菌命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens ZYTC1-1。本发明专利技术解淀粉芽孢杆菌筛选自健康刺参肠道，该菌株具有较强的产蛋白酶和淀粉酶能力，能够提高刺参肠道中淀粉酶活力，促进刺参的生长，提高刺参的免疫力和抗病力，可广泛应用于刺参的养殖及水产饲料领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及功能微生物筛选及应用
，具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌的筛选及其在刺参养殖上的应用。
技术介绍
随着国内外刺参需求量的增加及水产品贸易的国际化发展，近年来，刺参养殖业发展突飞猛进。但是，高密度养殖及不规范操作所导致的养殖环境恶化、疾病的发生给刺参养殖业带来了巨大的经济损失。传统防治疾病的方法主要是使用抗生素，抗生素使用易产生耐药性菌株问题，且存在动物体内残留问题，危害食品安全，因此寻找抗生素替代品成为必然。益生菌作为外源的添加剂可以参与动物体内的微生物平衡，直接通过增强动物对肠内有害微生物群落的抑制作用，或通过增强非特异性免疫功能来预防疾病，进而间接起到促进动物生长的作用，提高动物饲料的转化率。因此，近些年对于益生菌的筛选尤其是养殖动物土著菌的筛选成为本领域内的研究热点，也对水产饲料配方的改进具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株新型解淀粉芽孢杆菌及其在刺参养殖上的应用。所述解淀粉芽孢杆菌筛选自健康刺参肠道，该菌株具有较强的产蛋白酶和淀粉酶能力，能够提高刺参肠道中淀粉酶活力，促进刺参的生长，提高刺参的免疫力和抗病力，可广泛应用于刺参的养殖及水产饲料领域。本专利技术一方面提供了一株解淀粉芽孢杆菌，于2015年12月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心；请求保藏人：鲁东大学；保藏编号为CCTCCNO：M2015774，该菌命名为解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensZYTC1-1。本专利技术另一方面提供了上述解淀粉芽孢杆菌在刺参养殖中的应用。具体为：当刺参苗变态为稚参后，摄食能力进一步加强，每斤刺参在2000-4000头时，在鼠尾藻粉中以109CFU/g的添加量投喂上述解淀粉芽孢杆菌，连续投喂一个月。本专利技术筛选到的解淀粉芽孢杆菌ZYTC1-1，具有较强的产蛋白酶和淀粉酶的能力，促进刺参生长，降低刺参病害发生的几率。所述解淀粉芽孢杆菌ZYTC1-1可作为益生菌应用于刺参的养殖生产过程中，有效提高刺参肠道中淀粉酶活力，对刺参的生长具有显著的促进作用，还可以有效提高刺参的免疫力及对灿烂弧菌的抵抗能力。与对照组相比，添加109CFU/g解淀粉芽孢杆菌ZYTC1-1的益生菌组中刺参的终末平均体重、特定生长率、淀粉酶活性、吞噬活性、超氧化物歧化酶活性、总抗氧化力活性和一氧化氮合酶活性分别提高了17.72%、17.77%、81.34%、41.99%、8.47%、61.70%及54.21%，而累积死亡率下降了25%；取得了显著的技术效果。附图说明图1：本专利技术一株解淀粉芽孢杆菌ZYTC1-1的菌落形态。解淀粉芽孢杆菌ZYTC1-1，已于2015年12月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，其保藏编号为CCTCCNO：M2015774。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作更进一步的说明，以便本领域的技术人员了解本专利技术。实施例1菌株的分离、筛选、鉴定及安全性验证1、样品采集于烟台市莱州刺参养殖场的健康刺参的肠道。2、培养基：1)芽孢杆菌分离培养基：葡萄糖10g，磷酸钙5g，硫酸铵0.5g，氯化钾0.2g，七水硫酸镁0.1g，硫酸锰0.0001g，硫酸亚铁0.0001g，酵母提取物0.5g，蒸馏水1000ml，pH6.8-7.2，琼脂20g，121?C灭菌30min。2)改良的TSB培养基：胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）30g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，pH7.4-7.6，配制固体培养基加入15-20g的琼脂，121?C灭菌20min。3)淀粉水解培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，可溶性淀粉2g，蒸馏水1000ml，pH7.2-7.4，配制固体培养基加入15-20g的琼脂，115?C灭菌20min。4)酪素水解双层平板培养基：(1)溶液A：蛋白胨10g、酵母膏3g、琼脂10g、陈海水1000ml；(2)溶液B：酪蛋白10g、蒸馏水250ml；(3)溶液C：琼脂10g、蒸馏水250ml。在碱性条件下溶解酪蛋白，配制溶液B时，滴加NaOH溶液使酪蛋白刚好全部溶解。分别将三种溶液灭菌(121?C，20min)，待其都冷却到50?C左右，先将B液和C液混合，倒入平板形成一薄层，待薄层凝固后将A液倒入，制成双层平板。3、筛选方法健康刺参从养殖场采集后，加冰运输至实验室，无菌条件下解剖获得刺参肠道，肠道称重后，加入9倍体积的无菌生理盐水，用匀浆器在冰上进行研磨，充分研磨后进行10倍梯度稀释，接种芽孢杆菌分离培养基，28?C培养24h-48h。选取均匀清晰的单菌落，在改良的TSB培养基上划线纯化。纯化后的细菌，用改良的TSB液体培养基扩大培养，用甘油生理盐水-80?C保存。单菌落依次命名为ZYTC1-1、ZYTC1-2、ZYTC1-3、……、ZYTC1-9。将单菌落过夜培养16-18h，分别点种于淀粉水解培养基和酪素水解双层平板培养基上，每种菌点种3个重复，28?C恒温培养，48h形成明显菌落后观察透明圈的大小；淀粉水解培养基需滴加卢戈氏碘液。具体结果如表1所示。表1潜在益生菌株产酶能力注：1表示不产生蛋白酶或者淀粉酶，1-2表示产酶能力一般，>2表示产酶能力较强。从表1的数据可以看出，本专利技术筛选到的9株芽孢杆菌中菌株ZYTC1-1产蛋白酶和淀粉酶的能力最强。4、菌株鉴定1）菌落形态特征：将上述菌株ZYTC1-1重新划线培养，其单菌落呈现为扁平状、圆形、土黄色、边缘锯齿状，革兰氏染色阳性。2）提取上述菌株ZYTC1-1的基因组DNA，利用PCR技术扩增16SrDNA序列，通过测序获得ZYTC1-1的16SrDNA序列，具体序列见附件序列表的核苷酸序列，将该菌株的16SrDNA序列提交到GenBank数据库，获得序列号GenBankNO.KU588858。通过BLAST比对分析，其与已公布的多株解淀粉芽孢杆菌的16SrDNA序列相似度高达99%，鉴定证实菌株ZYTC1-1为解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens），与生化鉴定结果一致。3）将上述菌株ZYTC1-1命名为解淀粉芽孢杆菌ZYTC1-1（BacillusamyloliquefaciensZYTC1-1），已于2015年12月24日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO：M2015774。5、安全性验证...
【技术保护点】
一株解淀粉芽孢杆菌ZYTC1‑1，该菌种于2015年12月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，其简称为：CCTCC，其保藏编号为CCTCC NO：M 2015774，命名为Bacillus amyloliquefaciens ZYTC1‑1。
【技术特征摘要】
1.一株解淀粉芽孢杆菌ZYTC1-1，该菌种于2015年12月24日保藏于中国典型培养物保
藏中心，其简称为：CCTCC，其保藏编号为CCTCCNO：M2015774，命名为Bacillus
amyloliquefaciensZYTC1-1。
2.按照权利要求1所述的一株解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensZYTC1-
1，其16SrDNA序列见附件序列表的序列。
3.按照权利要求1所述的一株解淀粉芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：
1）、制备培养基
制备芽孢杆菌分离培养基、制备改良的TSB培养基、制备淀粉水解培养基、制备酪素水
解双层平板培养基；
2）、筛选
健康刺参从养殖场采集后，加冰运输至实验室，无菌条件下解剖获得刺参肠道，肠道称
重后，加入9倍体积的无菌生理盐水，用匀浆器在冰上进行研磨，充分研磨后进行10倍梯度
稀释，接种芽孢杆菌分离培养基，28?C培养24h-48h，选取均匀清晰的单菌落，在改良的TSB
培养基上划线纯化，纯化后的细菌，用改良的TSB培养基扩大培养，用甘油生理盐水-80?C保
存形成但菌落，将单菌落过夜培养16-18h，分别点种于淀粉水解培养基和酪素水解双层平
板培养基上，每种菌点种3个重复，28?C恒温培养，48h形成明显菌落。
4.按照权利要求1所述的一株解淀粉芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于
所述芽孢杆菌分离培养基：葡萄糖10g，磷酸钙5g，硫酸铵0.5g，氯化钾0.2g，七水硫酸
镁0.1g，硫酸锰0.0001g，硫酸亚铁0....
【专利技术属性】
技术研发人员：赵彦翠，袁磊，孙虎山，万军利，王旭静，王敏，陈昌，
申请(专利权)人：鲁东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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