一种编码金属蛋白酶的基因pme16A，其核苷酸序列如序列表No.1所示；氨基酸残基的序列如序列表No.2所示。序列表1中的DNA从5’端第1个核苷酸开始起始密码子ATG到第1461个核苷酸以终止密码子TAA结束，存在一个完整的ORF，核苷酸1-1461，自5’端的第1-3位核苷酸为pme16A基因的起始密码子ATG，自5’端的第1459-1461位核苷酸为pme16A基因的终止密码子TAA。本发明专利技术为金属蛋白酶的工业化生产应用提供了新的材料，可以有效弥补动植物源金属蛋白酶原材料的短缺现状，具有重要的研究价值和应用前景。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】一种编码金属蛋白酶的基因pme16A，其核苷酸序列如序列表No.1所示；氨基酸残基的序列如序列表No.2所示。序列表1中的DNA从5’端第1个核苷酸开始起始密码子ATG到第1461个核苷酸以终止密码子TAA结束，存在一个完整的ORF，核苷酸1-1461，自5’端的第1-3位核苷酸为pme16A基因的起始密码子ATG，自5’端的第1459-1461位核苷酸为pme16A基因的终止密码子TAA。本专利技术为金属蛋白酶的工业化生产应用提供了新的材料，可以有效弥补动植物源金属蛋白酶原材料的短缺现状，具有重要的研究价值和应用前景。【专利说明】—种编码金属蛋白酶的基因pme16A及其应用
本专利技术涉及一种编码金属蛋白酶的基因pmel6A及其应用。
技术介绍
金属蛋白酶(EC3.4.24._)是指其活性中心，依赖于金属离子的一类蛋白酶。大多数金属蛋白酶主要依赖二价阳离子，如锌离子、铜离子、钴离子和锰离子等。其中Zn2+最为普遍。金属蛋白酶容易被金属螯合剂强烈抑制。金属蛋白酶，分布广泛，性质特异，有着重要的经济和应用价值。由于金属蛋白酶的来源不同，所以大多数都具有自己与众不同的特点。一般具有耐高温或者嗜低温、耐有机溶剂、耐碱性、热敏感等特性。目前，金属蛋白酶类主要应用于食品、洗涤剂、化妆品、抗肿瘤药物和疾病机理研究等方面，而且应用于以上各行业中的金属蛋白酶大多源自于动植物，由于动植物源酶来源有限，限制了金属蛋白酶在生产生活上的进一步应用与发展。近年来，被确定的锌金属蛋白酶/肽酶的数量逐年增加。金属蛋白酶超家族的成员，都不同程度的涉及胚胎发育和骨骼形成，关节炎和癌症等。对不同金属蛋白酶之间的结构活性研究，有利于我们设计不同的工程金属蛋白酶。将金属蛋白酶的结合位点，引入蛋白质中，可以调节酶的活性，也有可能诱发可预测的特异构象变化。在对金属蛋白酶的氨基酸序列进行比对时，发现它们都拥有一段共同的锌离子结合位点序列HEXXH，其中H代表组氨酸残基，E代表谷氨酸残基，X代表任意的氨基酸残基。两个组氨酸残基，是作为锌的配基，谷氨酸残基作为常见的支点。含有保守的锌结合位点序列HEXXH的金属肽酶都被称为Zincins，根据锌离子第三个配基所在的位置，又把Zincins分成三个不同的族群，Gluzincins,即下游的谷氨酸残基作为锌离子的第三个配基,属于这一类的金属蛋白酶，包括嗜热菌蛋白酶，肽链内切酶，白三烯A4水解酶等。金属蛋白酶也广泛存在于植物的各种器官或组织中，植物幼嫩部分的含量较多，成熟部分含量较少。如:亮氨酸氨基肽酶(LAP)，是广泛存在于植物中的金属蛋白酶，序列和结构都很保守。在寄生虫中，有来`自亚马逊利什曼原虫的，亮氨酰氨基肽酶(Lap)，它是一个60kDa的蛋白质,与来源于革兰氏阴性菌、植物、哺乳动物中的LaP具有同源性。Eggleson等从食物泡中，纯化并鉴定了一种新的金属肽酶，镰形溶解素(Falcilysin)。这种金属肽酶，出现在疟原虫的天冬氨酸蛋白酶I和II，以及恶性疟原虫的半胱氨酸蛋白酶血色素水解功能的下游。它不能断裂球蛋白和血色素，但易断裂血色素的多肽片段。镰形溶解素的序列显示了 ME家族中M16金属肽酶的特点，具有一个倒转的HXXEH的活性位点基序。通过用随机的多肽对镰形溶解素进行分析，发现重组的镰形溶解素在酸性条件下，具有高度的活性。在中性条件下，也具有较低的活力，但是，却有不同的底物特异性。在锌金属蛋白酶中，嗜热菌蛋白酶和羧肽酶A，被认为是典型的模型来研究作用机制。在嗜热菌蛋白中，锌离子具有近四面体的结构，有三个残基提供(Hisl42，Hisl46,Glul66)还有一个是由水分子来提供。进来的底物，取代溶剂分子。锌离子在其中，扮演两个重要的角色，第一，使底物的羰基极化，第二，促进去质子化的水亲核试剂。在羧肽酶A中，在酶的催化中心，Zn2+与Hisl96，Glu72，His69结合，它具有以下作用，第一，通过Zn2+-OH键极化一个水分子，使其攻击底物易断裂的肽键，从而形成一个四面体的过渡态结构。第二，通过静电作用，稳定过渡态结构中的部分电荷。Argl27、Glu270协助形成过渡态结构，Argl27与底物的羰基结合，Glu270与水分子，通过氢键结合。Argl45，在Asnl44和Tyr248的协助下，对底物的结合，具有重要的作用。第225位的氨基酸被认为，是决定底物特异性的关键残基。Mpp (线粒体加工肽酶)是一种金属肽酶，专门裂解N-端信号肽序列。它的活性位点位于一个大的中央腔，在α和β亚基之间，内衬亲水性氨基酸，其中包括谷氨酸和天冬氨酸。信号肽的底物是富含带正电荷的氨基酸残基，因此，在底物结合区域，带负电荷的残基可以与之结合，形成稳定的静电相互作用的酶和底物。另外，高极性的空腔，不喜欢两亲性的α-螺旋结构。底物可到达活性位点的部位，被富含甘氨酸环(由a-MPP的284-301位残基组成)部分阻止。电子密度被甘氨酸环弱化，显示灵活。Arecent等人的研究表明，Mpp去除这个甘氨酸环后，对底物的亲合力降低以及催化活性降低。这些结果表明，Mpp中富含甘氨酸环，可能与底物的结合或产物的释放相关，可能取决于它的灵活度 。目前，获得金属蛋白酶的主要方式有:(1)从动植物组织中直接提取，分离纯化得到；这种方法要获得大量的蛋白酶，则需大量的生物体组织，且生物组织的前期处理较麻烦，价格较贵。(2)利用微生物发酵法生产金属蛋白酶。此方法有诸多优势，如成本低、获得量大、通过分泌表达系统使纯化更容易等。产金属蛋白酶的菌株可通过纯培养技术筛选得到，但由于各方面条件的限制，自然界约有99%的微生物不能通过纯培养技术来实现，在发掘新基因方面有一定的局限性，因此，宏基因组技术在发掘新基因方面得到越来越多的科学家的重视。宏基因组是指生境中全部微小生物遗传物质的总和，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和，通过宏基因组技术可绕过纯培养技术瓶颈。本专利技术从污染水样污泥中直接提取宏基因组总DNA，构建了环境宏基因组文库，通过直接测序筛选策略，结合生物信息学技术分析平台，获取了一个编码金属蛋白酶的基因pmel6A，完成了该基因的克隆表达，以及对其表达产物进行生理生化性质的鉴定，为金属蛋白酶的研究提供新的材料。本专利技术提供的新的金属蛋白酶可以为金属蛋白酶的工业化生产应用提供理论参考，可以有效弥补动植物源金属蛋白酶原材料的短缺现状，具有重要的研究价值和应用前景，在食品和疾病机理研究等方面具有广泛的用途。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种编码金属蛋白酶的基因pmel6A及其应用。本专利技术提供的一种编码金属蛋白酶的基因pmel6A的克隆方法包括下列步骤:(I)从广西某地污染水样(22° 84; N，108° 28, E)淤泥样本中提取未培养微生物宏基因组DNA，构建环境宏基因组文库；(2)基于序列特异性的筛选策略，从环境宏基因组文库中分离筛选包含金属蛋白酶新基因的克隆。本专利技术通过构建环境宏基因组文库，基于序列特异性的直接测序筛选策略，得到了一种新的编码金属蛋白酶的基因，可在宿主细胞中大量表达，产生的金属蛋白酶对酪蛋白底物有较好的水解能力。重组质粒菌株E.coli BL21 (DE3)/pGXM16已在中国本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种编码金属蛋白酶的基因pme16A，其特征在于，其核苷酸序列如序列表No.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋承建，黄捷，古恒森，曾蓉，陈高，申佩弘，武波，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：
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