本发明专利技术公开了水稻OsPAR1蛋白及其编码基因在调控植物百草枯抗性中的应用。本发明专利技术提供了一种提高或降低植物百草枯抗性的方法，及用于降低OsPAR1基因表达物质的发夹RNA、小干扰RNA及干扰载体和干扰片段。实验证明，过表达株系在0.5μM百草枯浓度下就有白化的表型且叶绿素含量明显下降，而干扰株系在0.5μM～5μM百草枯浓度下无白化表型且叶绿素含量无明显变化。两叶一心期，使用200μM百草枯水溶液对水稻叶片进行喷洒，2天后干扰株系植株叶片大部分都保持绿色，叶绿素分解较少；过表达株系植株叶片全部发白枯死。本发明专利技术为提高植物百草枯抗性或培育抗百草枯作物品种提供了一种新的途径，在农业生产上具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
水稻OsPARI蛋白及其编码基因在调控植物百草枯抗性中的应用
本专利技术涉及一种水稻OsPARl蛋白及其编码基因在调控植物百草枯抗性中的应用。
技术介绍
百草枯(paraquat,I, I，-dimethyl-4, 4，-bipiridyl ； I, I，_ 二甲基-4, 4，-联批叮，分子量257.2)是一种非选择性的速效触杀型除草剂，它是继草甘磷之后的第二大除草剂。百草枯被广泛应用于防除各种一年生杂草；对多年生杂草有强烈的杀伤作用，但其地下茎和根能萌出新枝；对已木质化的棕色茎和树干无影响。同时，百草枯还适用于防除果园、桑园、胶园及林带的杂草，也可用于防除非耕地、田埂、路边的杂草，对于玉米、甘蔗、大豆以及苗圃等宽行作物，可采取定向喷施百草枯来防除杂草。百草枯自上世纪六十年代由原英国卜内门化学工业有限公司(ICI)研究开发，迄今在农业种植中的广泛应用已经有50多年的历史，目前在世界范围内有100多个国家使用百草枯。百草枯在1984年首次被引进中国市场，自上世纪90年代以来，随着农业生产技术的发展，我国很多农药企业先后开始大量生产百草枯原药，目前百草枯已经在我国的农业生产得到广泛应用。百草枯为速效触杀型灭生性季胺盐类除草剂，植物对其吸收极其迅速，叶片接触百草枯以后，有效成分对叶绿体层膜破坏力极强，使光合作用和叶绿素合成很快中止，叶片着药后2-3小时即开始受害变色，百草枯对单子叶和双子叶植物绿色组织均有很强的破坏作用。在光下生长的植物中，百草枯主要作用于其叶绿体，叶绿体含有绿色植物的光合系统，能吸收光能并制造糖分。百草枯作用于光系统I (photosystem I )的光合膜系统,该系统能产生自由电子以推动 光合作用。光系统I产生的自由电子与百草枯离子发生反应，产生自由基结构。氧可以迅速将这些自由基还原，并在这一过程中产生过氧化物。产生的过氧化物具有极高的化学活性，它能攻击不饱和膜脂肪酸，迅速打开并分解细胞膜及组织。百草枯离子与自由基的反应过程中会反复产生更多的过氧化物，直至停止产生自由电子，植物将迅速枯萎死亡。因此，百草枯是光合作用的一种电子传递抑制剂。在光系统I中它还能竞争性地抑制NADP的还原，还原后的百草枯迅速再氧化产生一系列的超氧化物阴离子，活性氧自由基的毒害能引起脂质的过氧化反应和细胞膜的损伤。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供水稻OsPARl蛋白的新用途。该蛋白的氨基酸序列如序列表序列I所示，所述新用途即所述蛋白可用于调控目的植物的百草枯抗性，或调节序列表序列I所示蛋白表达量的物质或方法可用于调控目的植物叶片的百草枯抗性。本专利技术提供一种发夹RNA，其核苷酸序列由一个茎环序列及位于所述茎环序列两侧的序列A和序列B组成，所述序列A与所述序列B反向互补；所述序列A为序列表序列I所示蛋白的编码基因中200-500bp DNA转录得到的RNA序列。所述蛋白的编码基因中的200_500bp的DNA中含有所述蛋白的编码基因的5’UTR区或3’ UTR区的部分或全部。所述蛋白的编码基因具体可为序列表序列2所示的DNA分子，其中，所述5’UTR区为序列表序列2的自5’末端第I位至第127位核苷酸；所述3’ UTR区为序列表序列2的自5’末端第1781位至第2202位核苷酸。所述序列A具体可为序列表中序列3的自5’末端第I位至第430位核苷酸序列。所述茎环序列具体可为序列表中序列3的自5’末端第431位至第908位核苷酸序列。由上述任一所述发夹RNA衍生的小干扰RNA也属于本专利技术的保护范围。本专利技术提供上述任一所述RNA (发夹RNA或小干扰RNA)的编码基因。所述RNA的编码基因可为如下I)或2)的DNA分子:I)式I所示的DNA片段，(I) SEQ正向-X-SEQ反向，所述SEQtt是序列表序列2中包括第1763位至第2192位的核苷酸段，所述SEQg的序列与所述SEQtt的序列反向互补，所述X是所述SEQm与所述SEQg之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQIE向及所述SEQ反向均不互补；2)与I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且抑制序列表序列I所示蛋白表达的DNA分子。所述SEQ1^1的核苷酸序列具体可为序列表序列2中第1763位至第2192位核苷酸序列。本专利技术保护下述3)或4)的DNA分子:3)其核苷酸序列为序列表序列2的第1763位至第2192位核苷酸段；4)在严格条件下与3)限定的DNA序列杂交的DNA分子。本专利技术保护含有上述任一所述RNA的编码基因或DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。所述重组载体具体可为载体pTCK303-0sPARl_RNAi，所述载体pTCK303-0sPARl-RNAi为在载体pTCK303的SpeI和Kpn I的位点间插入了序列表序列4所示的DNA片段。本专利技术提供一种培育转基因植物的方法，是抑制目的植物中序列表序列I所示蛋白的表达，得到百草枯抗性高于所述目的植物的转基因植物。所述抑制目的植物中序列表序列I所示蛋白的表达可通过将上述任一所述RNA的编码基因导入目的植物中表达上述任一所述RNA实现；所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物具体为水稻。本专利技术还提供另一种培育转基因植物的方法，是将序列表序列I所示蛋白的编码基因导入目的植物中，得到百草枯抗性低于所述目的植物的转基因植物；所述序列表序列I所示蛋白的编码基因可为如下5) -9)中任一所述基因:5)序列表序列5所示的DNA分子；6)序列表序列2中第128位至1780位所示的DNA分子；7)序列表序列2所不的DNA分子；8)与5)或6)或7)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且编码序列表序列I所示蛋白的DNA分子；9)在严格条件下与5)或6)或7)或8)限定的DNA序列杂交且编码序列表序列I所示蛋白的DNA分子；所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物具体为水稻。所述严格条件可为如下:50°C，在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na3PO4和ImMEDTA的混合溶液中杂交，在50°C，2XSSC，0.1%SDS中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS,0.5MNa3PO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，I X SSC, 0.1%SDS中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS,0.5M Na3PO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，0.5XSSC,0.1%SDS 中漂洗；还可为:50°C，在 7% SDS,0.5M Na3POjP ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，0.1 X SSC,0.1%SDS中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS,0.5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在65。。，0.1XSSC,0.1%SDS中漂洗；也可为:在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65本文档来自技高网...
【技术保护点】
发夹RNA，其核苷酸序列由一个茎环序列及位于所述茎环序列两侧的序列A和序列B组成，所述序列A和序列B反向互补；所述序列A为序列表序列1所示蛋白的编码基因中200?500bp?DNA转录得到的RNA序列。
【技术特征摘要】
1.发夹RNA，其核苷酸序列由一个茎环序列及位于所述茎环序列两侧的序列A和序列B组成，所述序列A和序列B反向互补；所述序列A为序列表序列I所不蛋白的编码基因中200-500bp DNA转录得到的RNA序列。2.根据权利要求1所述的发夹RNA，其特征在于:所述蛋白的编码基因中的200-500bp的DNA中含有所述蛋白的编码基因的5’ UTR区或3’ UTR区的部分或全部； 所述蛋白的编码基因具体为序列表序列2所示的DNA分子； 和/或所述序列A具体为序列表中序列3的自5’末端第I位至第430位核苷酸序列； 和/或所述茎环序列具体为序列表中序列3的自5’末端第431位至第908位核苷酸序列。3.由权利要求1或2所述发夹RNA衍生的小干扰RNA。4.权利要求1-3中任一所述RNA的编码基因； 所述RNA的编码基因具体为如下I)或2)的DNA分子: 1)式I所示的DNA片段，(I)SEQm-X-SEQ反向， 所述SEQ1^1是序列表序列2中包括第1763位至第2192位的核苷酸段， 所述SEQ的序列与所述SEQm的序列反向互补， 所述X是所述SEQ1^1与所述间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ1向及所述SEQfiJg不互补； 2)与I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且抑制序列表序列I所示蛋白表达的DNA分子。5.根据权利要求4所述的编码基因，其特征在于:所述SEQ1^1的核苷酸序列是序列表序列2中第1763位至第2192位核苷酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：白蛟腾，张健，左建儒，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：
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