本发明专利技术涉及构建一种通过分子影像学的方法动态监测Stat3表达水平的细胞系。该细胞系是将一种能指征Stat3表达水平的荧光素酶报告基因质粒通过慢病毒包装的方式转染到小鼠胚胎干细胞中，从而获得稳定转染了该报告基因的细胞系；在LIF激活Stat3并使Stat3发生磷酸化的前提下，p‑Stat3能入核与质粒上的p‑Stat3识别序列结合并进而启动下游荧光素酶基因Renilla的表达，在加入底物腔肠素后，Renilla利用细胞内的ATP氧化分解底物，并释放一个光子，释放的光子数与Stat3的激活水平成正比，因而利用该细胞系可以实现连续、动态地的监测Stat3的激活水平；因为成像底物能被荧光素酶氧化分解，对于细胞活性并无侵入性，而且可以在不同的时间点进行连续的成像监测Stat3激活的动态过程，这也是本细胞系优于传统实验方法的一大创新之处。
A cell line for dynamically monitoring the expression level of Stat3 by molecular imaging
The invention relates to a cell line for dynamically monitoring the expression level of Stat3 by means of molecular imaging. This cell line is an indication of the level of expression of Stat3 luciferase reporter plasmid through lentiviral packaging methods were transfected into mouse embryonic stem cells, so as to obtain the stable transfection of reporter gene cell line; activation of Stat3 in LIF and Stat3 phosphorylation under the premise that P Stat3 can enter P Stat3 recognition sequence and plasmid binding and nuclear expression and activate the downstream luciferase gene in Renilla, adding substrate coelenterazine, Renilla by ATP intracellular oxidative decomposition of substrate, and the release of a photon, photon number release and activation of Stat3 level is proportional to the level of activation and the use of this cell line can be to achieve the continuous and dynamic monitoring of Stat3; because the imaging substrate can be oxidized and decomposed for luciferase activity of cells, is not invasive, but also in different time point Continuous monitoring of the dynamic process of Stat3 activation, which is a major innovation of the cell line is better than the traditional experimental methods.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及构建一种通过分子影像学的方法动态监测Stat3表达水平的细胞系的方法，属于生物与新医药
技术介绍
信号传导与转录激活因子3(signaltransducerandactivatoroftranscription3,Stat3)是Stat蛋白家族成员之一，可以被许多细胞因子、生长因子和其它刺激激活，Stat3参与体内一条非常重要的信号通路Jak/Stat3信号通路，在肿瘤的增殖、分化、侵袭转移、血管形成以及免疫逃避等方面均发挥着重要的生理功能。除此之外，Jak/Stat3信号通路对小鼠胚胎干细胞（mouseembryonicstemcells,mESC）的自我更新及多向分化潜能的维持中也发挥着重要作用，细胞因子如白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor,LIF)与细胞表面的受体LIFR结合，LIFR与gp130亚基形成二聚体，导致与gp130相连的Jak激酶发生磷酸化，进而使得Stat3分子C-末端的酪氨酸残基（Y705）发生磷酸化，通过其SH2区形成二聚体而激活，并转移到细胞核内与靶基因的启动子结合，进而激活下游靶基因的表达，如干性维持基因Oct4、Nanog，组成干性基因调控网络，相互协调共同促进胚胎干细胞自我更新特性的维持。分子影像学（MolecularImaging）指用影像学的方法在活体的条件下反映细胞和分子水平的变化。相对于离体检测，其优势在于实时、无创地对同一机体进行纵向动态的观察。而其中的生物发光成像技术是采用荧光素酶(Luciferase)基因来标记细胞或DNA，再利用流式细胞仪分选（构建的载体上有荧光报告基因）的方法筛选出稳定转染荧光素酶的细胞，p-STAT3与7个串联重复序列增强子结合后，促进TA启动子激活下游海肾荧光素酶（RenillaLuciferase）的表达，转录生成荧光素酶Renilla，在加入成像底物腔肠素（Coelenterazine）后，Renilla催化底物发生氧化还原反应，并释放光子，通过小动物成像仪对产生的光子数进行统计，光子数与Stat3的激活水平成正比，从而实现对Stat3激活水平的动态监控。
技术实现思路
本专利技术是一种可以通过分子影像学的方法动态监测Stat3表达水平的细胞系。本专利技术是通过将带有荧光素酶报告基因的目的质粒以及两种包装质粒通过慢病毒包装的方式稳定转染到目的细胞中的方法。其中，所述哺乳动物细胞为小鼠胚胎干细胞。所述转基因细胞也属于专利技术的保护范围。本专利技术的方法能利用小动物成像仪通过对荧光素酶对底物氧化生成的光子数来指征Stat3的激活水平，相较于传统的Real-TimePCR以及WesternBlot，优点在于简单快捷、灵敏性高且无侵入性从而实现动态监测Stat3的表达水平。附图说明图1为p-Stat3载体结构示意图，该质粒实现将p-Stat3这个质粒通过慢病毒包装的方式稳定转染到小鼠胚胎干细胞中。图2为以GFP为筛选标记通过流式分选得到的稳定转染了p-Stat3质粒的细胞。图3为通过流式分选得到的稳定转染了GFP的细胞扩大培养后形成克隆的荧光照片。图4为转染了p-Stat3的质粒构建而成的细胞系与野生型细胞的增殖检测，发现转染了p-Stat3的细胞增殖速度虽然相较于野生型细胞有所减慢，但是并没有显著性差异。图5为LIF激活Jak/Stat3信号通路，从而激活p-Stat3并进而激活RenillaLuciferase，在加入底物腔肠素后，荧光素酶催化底物氧化分解释放光子，光子数与细胞数目呈很好的线性关系。图6为加入LIF和不加LIF两种处理条件下，在不同的时间点对细胞进行成像，可以发现在加入LIF处理12h后，与对照组相比，LIF可以明显激活Stat3的表达。图7为通过WesternBlot的传统实验手段检测LIF对Stat3以及Stat3的酪氨酸705位点的磷酸化的表达的影响，实验结果观测LIF能明显使Stat3发生磷酸化，实验结果和成像的结果吻合。具体实施方式下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可以从商业途径获得。慢病毒包装质粒系统购于美国Biosettia公司。Lipo-2000转染试剂购于Sigma公司，海肾荧光素酶底物coelenterazine购于Promesa公司慢病毒包装步骤如下：将293T细胞用不含双抗的MEF培养基（DMEM+血清+谷氨酰胺）进行培养，待其密度长至60%-80%后准备用于脂质体转染。在200ulOpti-mem稀释质粒混合物：其中目的质粒p-Stat3的加入量为3ug，包装质粒psPAX2和pMD2.G的加入量分别为2ug和1ug，然后在200ulOpti-mem稀释6ulLipo2000，静置15min后，将含质粒的混合液加入到Lipo的混合液中，轻轻混匀，静置15-20min。之后将质粒和Lipo的混合液加入到事先加了1.6ml无双抗MEF培养基的293T细胞中，轻轻混匀。转染24h后，用PBS洗2次，换为ES全培养基。转染48h后，收病毒上清，4500rpm离心15min或0.45um滤膜过滤去除细胞碎片，可直接用于细胞感染。小鼠胚胎干细胞感染步骤如下：将ES细胞用PBS洗两次后消化、MEF中止、离心后，用1ml培养基+1ml病毒液重悬后转移至六孔板。.加入3ulPolybere，轻轻混匀，在培养箱中过夜孵育。第二天弃去病毒液，PBS洗三次，换成完全培养液，或为提高感染效率，可再用病毒转染一次。细胞系功能检测。如图3所示，将病毒液感染胚胎干细胞后进行扩大培养，以GFP为筛选标记进行流式分选，筛选出稳定转染了GFP的细胞培养建系，荧光显微镜下可观察到p-Stat3质粒上组成性表达GFP呈现出绿色荧光。而且我们将转染后的细胞按照细胞个数进行梯度分组，在LIF激活Jak/Stat3信号通路的前提下，加入底物腔肠素后，发现成像仪器捕捉到的光子数与细胞个数形成很好的线性关系，表明我们构建的细胞系是成功的稳定转染了p-Stat3质粒的并且能稳定表达荧光素酶报告基因Renilla。LIF对Stat3的激活作用的验证：在加入LIF和不加LIF两种培养条件下，因为LIF可以激活Jak激酶，Jak激酶进而使Stat3的酪氨酸705位点发生磷酸化使之激活，两个激活的Stat3结合形成二聚体后，p-Stat3能与整合到基因组上作为增强子的p-Stat3结合序列结合，大大提高下游海肾荧光素酶序列Renilla的表达，使之通过转录、翻译为荧光素酶Renilla。在加入底物腔肠素后，Renilla利用细胞内的ATP氧化分解底物腔肠素并释放一个光子，利用Livingimaging软件对两个处理组的光子数分别在1h，3h，6h和12h进行统计，发现在12h，LIF处理组的光子数明显高于对照组，而且腔肠素本身对对细胞活性无侵入性，从而说明可以利用本细胞系对Stat3的激活水平进行连续地、动态地、无侵入性的监测。图7为通过WesternBlot检测LIF对Stat3以及Stat3的酪氨酸705位点的磷酸化的表达的影响，实验结果观测LIF能明显使STAT3发生磷酸化，实验结果和成像的结果吻合，说明可以利用本细胞系进行成像这种实验方法来替代传统实验方法，而且因为本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种转基因细胞，是将一种能够指征Stat3的荧光素酶报告基因通过慢病毒包装的转染方式整合到哺乳动物细胞中，通过流式分选得到稳定表达荧光素酶Renilla报告基因的细胞系。
【技术特征摘要】
1.一种转基因细胞，是将一种能够指征Stat3的荧光素酶报告基因通过慢病毒包装的转染方式整合到哺乳动物细胞中，通过流式分选得到稳...
【专利技术属性】
技术研发人员：王丹，李宗金，刘娜，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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