复合病毒由简单蛋白质亚单元通过顺序且不可逆的装配方式装配。在噬菌体中包装基因组过程中，有力的分子马达在空的前头部的入口顶点处装配以启动包装。本发明专利技术一方面涉及高度泛宿主性的T4噬菌体包装机器，其将DNA转移至完成的噬菌体头部以及前头部中。单个的马达能够迫使外源DNA以与进入前头部同样的速度进入噬菌体头部，且噬菌体头部经历反复起始，包装多DNA分子进入同一头部。这显示所述噬菌体DNA包装机器具有非凡的构象可塑性，支持DNA进入明显被动衣壳容器，包括高度稳定的病毒壳，直至其装满。该特征允许设计新等级的纳米衣壳递送媒介物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术大体上涉及蛋白质和核酸递送组分、组合物、递送它们的机制和方法。
技术介绍
成熟的衣壳的壳(shell)的包装能力尚未被发现。对改善的基因治疗的媒介物(vehicle)，特别是对能够递送核酸和蛋白质二者的平台，仍有很大需求。突出的问题涉及基因包装的低效率、被递送基因物质的低量、弱的靶向以及组织特异性的缺乏。其他用于核酸和蛋白质递送的方法有很多限制例如，裸DNA的注射有非常低的表达；电穿孔有伴随其的高的细胞死亡率；许多病毒载体只能携带少量的用于递送的核酸；以及伴随阳离子脂质体递送的可能有计量相关的毒性。有需要开发解决所述问题的平台。
技术实现思路
根据一个广泛的方面，本专利技术提供了一种方法，该方法包括以下步骤(a)附着包装马达至载体(carrier)，以及(b)转移外源物质进入到所述载体的内隔室以因此形成包装机器。附图说明并入这里的且是说明书组成部分的后附附图，图解说明本专利技术的示例性实施方式，并且与上述概括的描述以及以下给出的详细描述一起，用于解释本专利技术的特征。图1是显示通过顺序装配和泛宿主装配的DNA包装的示意图。图2是显示通过氯化铯(CsCl)梯度离心后差速离心的噬菌体头部的隔离的照片。图3是显示随着通过二乙氨基乙基琼脂糖柱层析(DEAE-SepharoseCoIumnchromatography)部分头部的纯化的峰的曲线图。图4是显示在不同阶段头部的分离的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGEgel)的图像。图5是用Gp17抗体探测的蛋白质印迹膜的图像。图6是显示用DNA酶I和/或蛋白酶K处理、并经历琼脂糖凝胶电泳且用赛博绿(cybergreen)染色的曬菌体头部的凝胶图像。图7是显示在诸如有和没有DNA以及有和没有Gpl7的不同条件下包装短DNA片段至噬菌体头部的凝胶图像。图8是显示在诸如有和没有DNA、有和没有Gpl7以及有和没有三磷酸腺苷(ATP)的不同条件下包装短DNA片段至噬菌体头部的凝胶图像。图9是显示在DNA酶存在下裂解的噬菌体头部的梯度离心后差速离心的图像。图10是显示在包装反应中使用的颗粒浓度的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGEgel)的图像。 图11是凝胶图像，其中来自所述梯度的充满的头部的带，使用蛋白酶K进行处理，并在聚丙烯酰胺凝胶上电泳。图12是凝胶图像，其中来自所述梯度的部分的头部的带，使用蛋白酶K进行处理，并在聚丙烯酰胺凝胶上电泳。图13是显示所述用于单分子DNA包装的双光讲装置(dual optical trap setup)的简图。图14是显示通过前头部的DNA的包装的图。图15是显示通过部分头部的DNA的包装的图。图16是显示通过充满的头部的DNA的包装的图。图17是显示通过充满的头部的DNA的包装的图。图18是显示通过充满的头部的DNA的包装的图。图19是显示用包装有Cy3DNA的固定的T4头部的荧光图像量化的示意图像。图20是显示用包装有Cy5的固定的T4头部的荧光图像量化的示意图像。图21是显示在单分子荧光检测中包装有Cy3DNA的头部的数量的柱状图。图22是显示在单分子荧光检测中包装有CyOTNA的头部的数量的柱状图。图23显示包装有Cy539_bpDNA的部分头部、前头部、或充满的头部的代表性图像。图24显示包装有Cy383_bpDNA的部分头部、前头部、或充满的头部的代表性图像。图25是显示用于部分头部和前头部的单个头部强度(single-head intensity)的标准化柱状图。图26是显示来自单个固定的包装的头部的、典型的光致褪色步骤的曲线图，所述头部包装有多重Cy5标记的DNA片段。优选实施方式的详细描述术语除非特别说明，术语的意思违背该术语通常使用的意思的地方，申请人意在使用以下提供的术语。用于本专利技术的目的，所述术语“卩遼菌体的组成部分(bacteriophage component)”是指噬菌体以及噬菌体衍生物，包括具有抗原、融合蛋白和其他类型分子附着其上的噬菌体和噬菌体衍生物。例如，所述术语“T4噬菌体组成部分”是指T4噬菌体和T4噬菌体的衍生物。用于本专利技术的目的，所述术语“噬菌体衍生物”是指包括噬菌体蛋白质外壳(protein coat)至少一部分的任何结构。曬菌体衍生物的实例是,其中外源DNA被包装在定型的卩遼菌体基因组(customized bacteriophage derivative)中，在例如Jiang等人“在曬菌体T4衣壳表面上展示形成脑膜炎奈瑟菌PorA肽(Display of aPorA Peptide formNeisseria meningitidis on the Bacteriophage T4 Capsid surface),，，传染与免疫(Infection and Immunity) 65 :4770-77 (1997)、Clark JR和March JB,“卩遼菌体介导的核酸免疫(Bacteriophage-mediated nucleic acid immunization) ”,欧洲微生物学会联合会免疫学与医学微生物学(FEMS Immunology and MedicalMicrobiology), 40, 21-26 (2004)以及March等人,“使用完整入颗粒遗传免疫对抗乙型肝炎(Genetic immunisationagainst hepatitis B using whole bacteriophagelambda particles),，，疫苗(Vaccine),22，1666-71 (2004)”中得到描述，所述文献全部内容和公开这里并入作为参考。噬菌体衍生物的另一个实例是噬菌体衣壳。噬菌体衍生物的再一个实例是噬菌体尾部。在本专利技术的一种实施方式中，使用Kondabagil等人，“噬菌体T4包装马达的DNA移位ATP酶(TheDNA transIocatingATPase Of bacteriophage T4 packaging motor),，，分子生物学杂志(J. Mol. Biol.)，363 :786-99 (2006)中描述的方法可以将外源DNA装载至空T4衣壳中，所述文献全部内容和公开这里并入作为参考。用于本专利技术的目的，所述术语“结合(bind)”、所述术语“结合着(binding)”以及所述术语“结合上(bound)”是指任何类型的化学或物理的结合，其包括但不限于共价结合、氢键结合、静电结合、生物栓系(biological tethers)、跨膜附着(transmembraneattachment)、细胞表面附着和表达。用于本专利技术的目的，所述术语“生物样品(biological sample) ”以及所述术语“生物标本(biological specimen) ”是指体外或体内的人、动物、微生物或植物的部分或者全 部。所述术语包括但不限于人、动物、微生物或植物来源的物质，诸如人、动物、微生物或植物的组织切片、细胞或组织培养物，人、动物、微生物或植物的细胞悬液或者它们的分离的部分，人或动物活组织检查、血液样品、含有细胞的体液和分泌物。用于本专利技术的目的,所述术语“衣壳外壳蛋白(capsid coat protein) ”是指以许多拷贝本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.04.09 US 61/322,334;2011.04.08 US 13/082,4661.一种方法，该方法包括以下步骤 (a)附着包装马达至载体，以及 (b)转移外源物质进入到所述载体的内隔室以因此形成包装机器。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述载体是病毒颗粒。3.根据权利要求1所述的方法,其中,所述载体是噬菌体组成部分。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述载体是噬菌体的衍生物。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述载体是T4噬菌体的成熟衣壳的壳。6.根据权利要求5所述的方法,其中,所述成熟衣壳的壳是部分的曬菌体头部或充满的噬菌体头部。7.根据权利要求3所述的方法，其中，所述噬菌体的组成部分由包括在噬菌体的颈部和/或尾部蛋白中的突变的核酸来编码。8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述噬菌体的组成部分包括在基因10和/或基因13中的突变。9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述在基因10中的突变是在色氨酸430残基位置上编码终止子。10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述在基因13中的突变是在谷氨酰胺39残基位置上编码终止子。11.根据权利要求7所述的方法，其中，所述噬菌体的组成部分还包括一个或多个编码衣壳的壳蛋白的基因的缺失。12.根据权利要求11所述的方法，其中，基因是hoc基因和/或S0C基因。13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述包装马达包括蛋白复合体。14.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：维尼加拉·绕，
申请(专利权)人：美国天主教大学，
类型：
国别省市：
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