用于人类基因组重塑的基于噬菌体的人工病毒设计制造技术

描述了一种用生物分子编程的“人工病毒”(AV)，其可以进入人类细胞并进行精确的人类基因组修饰。AV包含：至少一种病毒载体，诸如噬菌体T4；至少一种治疗性分子，诸如DNA、RNA、蛋白质，及它们的复合物；和脂质包衣。还描述了使用这种AV进行人类基因组修饰的方法，以及对这种AV进行编程的方法。AV进行编程的方法。AV进行编程的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于人类基因组重塑的基于噬菌体的人工病毒设计
[0001]政府利益声明
[0002]本专利技术是在美国国立卫生研究院(NIH)授予的资助号AI111538和AI081726以及美国国立科学基金会(NSF)授予的资助号MCB
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0923873的政府支持下完成的。政府拥有本专利技术的某些权利。
[0003]对“序列表”的引用
[0004]本申请包括以ASCII文本格式电子提交的序列表。该序列表被命名为109007
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23787US01_sequence listing.TXT，创建于2021年6月7日，大小为51445字节，并且通过引用其全部内容并入本文。


[0005]本公开总体上涉及人类基因组重塑组分、组合物、机制及其方法。

技术介绍

[0006]设计可以进入人类细胞并进行精确的分子修复且用生物分子编程的“人工病毒”(AV)，这在医学上有广泛的应用。然而，配制能够有效且安全地将治疗性基因和蛋白递送到靶细胞中以重塑人类基因组的AV颗粒仍然是重大挑战。本申请克服了这里描述的现有技术的不足。

技术实现思路

[0007]根据第一个主要方面，本公开提供了一种重塑(remodeling)人类基因组的人工病毒(AV)，包含：至少一种病毒载体；至少一种治疗性分子；和脂质包衣(lipid coating)，其中所述治疗性分子中的至少一种具有基因修饰或基因沉默活性。
[0008]根据第二个主要方面，本公开提供了一种重塑人类基因组的人工病毒(AV)，包含：T4衣壳；Cas9蛋白；至少一种RNA；至少一种DNA；和脂质包衣，其中，所述DNA被包装在所述T4衣壳内，其中，所述RNA选自由mRNA、siRNA和gRNA组成的组，其中，所述脂质包衣包含至少一种阳离子脂质。
[0009]根据第三个主要方面，本公开提供了一种基因组修饰方法，包括：用人工病毒(AV)感染动物细胞，其中，所述AV包含病毒载体、至少一种治疗性分子和脂质包衣，其中，所述至少一种治疗性分子具有基因修饰或基因沉默活性。
[0010]根据第四个主要方面，本公开提供了一种基于CRISPR的对具有基因组修饰能力的人工病毒(AV)进行编程(programming)的方法，包括：通过使野生型T4噬菌体中缺失ipI和ipII基因来产生“受体”噬菌体；用含有靶蛋白基因的质粒和表达Cas9或Cpf1的间隔子质粒以及CRISPR RNA来产生宿主细菌细胞，所述CRISPR RNA对应于所述受体噬菌体的缺失区域中的原间隔序列(protospacer)；用所述“受体”噬菌体感染所述宿主细菌细胞；从所述宿主细菌细胞回收工程化的“受体”噬菌体；从工程化的“受体”噬菌体获得空的工程化的T4衣壳；将至少一种DNA包装在所述工程化的T4衣壳中，其中，靶蛋白的基因在C
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末端侧翼接有
衣壳靶向序列(CTS)并且在N
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末端侧翼接有核定位序列(NLS)，以形成CTS
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基因
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NLS序列。
附图说明
[0011]本专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。在请求并且支付必要的费用后，专利局将提供本专利或专利申请出版物的彩色附图的副本。
[0012]附图并入本文并构成本说明书一部分，示出了本专利技术的示例性实施方式，并且与上文给出的一般描述和下文给出的详细描述一起用于解释本专利技术的特征。
[0013]图1是根据本专利技术的一个示例性实施方式的基于噬菌体T4的人工病毒的示意图。
[0014]图2是根据本专利技术的一个示例性实施方式的生成T4
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AV的顺序组装线的示意图。
[0015]图3是示出了根据本专利技术一个实施方式的经脂质包覆的T4
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AV的图。
[0016]图4是示出了根据本专利技术的一个示例性实施方式，在不同DNA与T4比例下，对于各种T4
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AV，量化经包装的GFP和荧光素酶DNA的图。
[0017]图5是示出了根据本专利技术的一个示例性实施方式，在不同的感染复数(MOI)下，通过T4(GFP)
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AV将经包装的DNA递送到293细胞中的图。
[0018]图6是示出了根据本专利技术的一个示例性实施方式，T4和脂质复合体积对DNA递送效力(Efficacy)的影响的图。
[0019]图7是示出了根据本专利技术的一个示例性实施方式，T4和脂质复合时间对DNA递送效力的影响的图。
[0020]图8是示出了根据本专利技术的示例性实施方式，用不同阳离子脂质包覆的AV的转导效率的图。
[0021]图9是示出了根据本专利技术的一个示例性实施方式，T4头部颗粒与LPF2K浓度对递送效力和细胞存活力的最佳比例的图。
[0022]图10是示出了根据本专利技术的一个示例性实施方式，T4头部颗粒与LPF2K浓度对递送效力和细胞存活力的最佳比例的图。
[0023]图11是示出了根据本专利技术的一个示例性实施方式，在不同的DNA与T4比例下，相对T4
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AV，量化被包装的VRC01质粒的图。
[0024]图12是示出了根据本专利技术的一个示例性实施方式，量化由转导的细胞分泌的VRCO1抗体的量的图。
[0025]图13是示出了根据本专利技术的一个示例性实施方式，在不同的DNA与T4比例下，相对T4
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AV，量化被包装的VRC01和CH58质粒的图。
[0026]图14是示出了根据本专利技术的一个示例性实施方式，量化由转导的细胞分泌的VRCO1和CH58抗体的量的图。
[0027]图15是示出了根据本专利技术的一个示例性实施方式，比较T4
‑
AV和AAV的转导效率的图。
[0028]图16是示出了根据本专利技术的一个示例性实施方式，在存在不同化合物下，比较荧光素酶表达的图。
[0029]图17是示出了根据本专利技术的一个示例性实施方式，存在不同化合物时GFP表达的比较的图。
[0030]图18是示出了根据本专利技术的一个示例性实施方式，用TBA处理增强T4
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AV递送的
图。
[0031]图19是示出了根据本专利技术的一个示例性实施方式，由T4
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AV运载的蛋白和DNA货物的位置的示意图。
[0032]图20是示出了根据本专利技术的一个示例性实施方式，β
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Gal
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Soc在T4衣壳上展示的图。
[0033]图21是示出了根据本专利技术的一个示例性实施方式，Cre
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Hoc在T4衣壳上展示的图。
[0034]图22是示出了根据本专利技术的一个示例性实施方式，各种Soc
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和Hoc
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融合蛋白在T4衣壳上展示的图。
[0035]图23是示出了根据本专利技术的一个示例性实施方式，在不同的DNA与T4比例下，相对T4
‑
AV本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种重塑人类基因组的人工病毒(AV)，包含：至少一种病毒载体；至少一种治疗性分子；和脂质包衣，其中，所述治疗性分子中的至少一种具有基因修饰或基因沉默活性。2.根据权利要求1所述的AV，其中，所述至少一种病毒载体选自由以下项组成的组：λ噬菌体，芽孢杆菌噬菌体Phi29，大肠杆菌噬菌体T2、T3、T4和T7，肠杆菌噬菌体P22，噬菌体SPP1，疱疹病毒，腺病毒，腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒，慢病毒。3.根据权利要求1所述的AV，其中，所述至少一种治疗性分子选自由DNA、RNA、蛋白及它们的复合物组成的组。4.根据权利要求1所述的AV，其中，所述至少一种治疗性分子被包装在所述病毒载体内。5.根据权利要求1所述的AV，其中，所述至少一种治疗性分子展示在所述病毒载体外部，其中，所述治疗性分子通过选自由Hoc和Soc组成的组中的至少一种蛋白与所述病毒载体结合。6.根据权利要求5所述的AV，其中，所展示的治疗性分子包含由选自由核糖核蛋白(RNP)复合物、位点特异性重组酶Cre、RNA聚合酶和DNA连接酶组成的组中的至少一种。7.根据权利要求6所述的AV，其中，所述RNP复合物包含Cas9蛋白和选自由mRNA、siRNA和gRNA组成的组中的至少一种RNA分子，其中，所述Cas9蛋白通过选自由Hoc和Soc的组成的组中的至少一种蛋白与T4衣壳相连。8.根据权利要求7所述的AV，其中，Cas9
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Soc包括SEQ ID NO:16中所示的序列。9.根据权利要求7所述的AV，其中，核定位序列(NLS)融合到Cas9蛋白的N
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末端。10.根据权利要求6所述的AV，其中，所述RNP复合物包含Cpf1蛋白和选自由mRNA、siRNA和gRNA组成的组中的至少一种RNA分子，其中，所述Cpf1蛋白通过选自由Hoc和Soc组成的组中的至少一种蛋白与T4衣壳相连。11.根据权利要求10所述的AV，其中，Cpf1
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Soc包括SEQ ID NO:17中所示的序列。12.根据权利要求1所述的AV，其中，所述脂质包衣包括至少一种阳离子脂质。13.根据权利要求12所述的AV，其中，所述阳离子脂质是选自由Lipofectamine 2000(LPF2K)、LPFRNAiMAX、LPF3K、LPFLTX、LPFStem
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、EXPI和FECT组成的组中的至少一种。14.根据权利要求2所述的AV，其中，所述AV包含至少两个通过蛋白交叉桥相连的病毒载体。15.根据权利要求14所述的AV，其中，所述蛋白交叉桥是Soc
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生物素
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亲和素(SBA)或Hoc
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BAP
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【专利技术属性】
技术研发人员：维尼加拉，
申请(专利权)人：美国天主教大学，
类型：发明
国别省市：