靶向光肩星天牛嗅觉共表达受体基因的dsRNA及应用制造技术

本发明专利技术涉及分子生物技术领域，具体提供了一种靶向光肩星天牛嗅觉共表达受体基因的dsRNA，所述dsRNA以如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为模板，采用dsRNA合成试剂盒合成得到。本发明专利技术还提供了所述dsRNA或者包括SEQ ID No.1所示核苷酸序列的光肩星天牛嗅觉共表达受体AglaOrco基因在光肩星天牛防治中的应用。该dsRNA可干扰光肩星天牛雌雄成虫在两性间和寄主植物之间的嗅觉识别和信息交流过程，阻断其正常两性交配和寄主取食过程，进而有助于害虫防治。虫防治。虫防治。

【技术实现步骤摘要】
靶向光肩星天牛嗅觉共表达受体基因的dsRNA及应用


[0001]本专利技术涉及分子生物
，尤其涉及一种靶向光肩星天牛嗅觉共表达受体基因的dsRNA及应用。

技术介绍

[0002]光肩星天牛Anoplophora glabripennis、属鞘翅目Coleoptera、天牛科Cerambycidae、沟胫天牛亚科Lamiinae、星天牛属Anoplophora。该虫源发于中国和朝鲜半岛，主要分布在我国北京、辽宁、江西、山西、内蒙古等20多个省市自治区。随着国际贸易的发展，光肩星天牛对林业生产造成了不可估量的损失，引起了世界各国的高度重视。
[0003]由于光肩星天牛主要以幼虫危害寄主植物内部，危害早期很难发现，自然控制作用较弱，加之其主要危害杨树等高大的阔叶树种，物理、化学和生物防治等措施较为困难。同时，雄性聚集信息素和寄主植物挥发物混合的引诱剂也已经用于林间的监测与防治，但是引诱效果并不理想(多个年份诱捕数量不超过100头，而其他近缘属如墨天牛属的引诱剂诱捕数量可达2000头以上)。因此，急需寻找新的途径筛选开发更为有效的活性化学物质用于林间防治。

技术实现思路

[0004]有鉴于
技术介绍
中存在的技术问题，本专利技术的目的是提供一种靶向光肩星天牛嗅觉共表达受体基因的dsRNA及应用。
[0005]具体的，本专利技术的技术方案如下：
[0006]第一方面，本专利技术提供了一种靶向光肩星天牛嗅觉共表达受体基因的dsRNA，所述dsRNA以如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为模板，采用dsRNA合成试剂盒合成。光肩星天牛嗅觉共表达受体AglaOrco基因的核苷酸序列包括SEQ ID No.1，其编码的蛋白质氨基酸序列包括SEQ ID No.2。该氨基酸属于疏水、非分泌蛋白，在内质网上拥有7个跨膜螺旋结构，属于典型受体蛋白。在本专利技术中，所述dsRNA的核苷酸序列优选包括SEQ ID No.3，或，SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能的编码核苷酸序列。
[0007]第二方面，本专利技术提供了所述dsRNA，或者包括SEQ ID No.1所示核苷酸序列的光肩星天牛嗅觉共表达受体AglaOrco基因在防治害虫中的应用。目前，在鞘翅目上对于Orco基因的研究主要集中在基因鉴定、基因进化关系和基因表达的探索；关于其参与的嗅觉识别机制的功能研究以及针对靶标基因的产品开发未见报道。在本专利技术中，所述害虫优选包括光肩星天牛成虫。
[0008]具体的，防治优选包括如下至少一种：
[0009](1)降低害虫对繁殖行为信息素的嗅觉响应；
[0010](2)降低害虫对寄主植物挥发物的嗅觉响应。
[0011]其中，所述繁殖行为优选包括交配行为。所述繁殖行为信息素优选包括(Z)
‑9‑
二
十三碳烯。所述寄主植物挥发物优选包括3
‑
蒈烯和/或罗勒烯。
[0012]在本专利技术提供的具体实施方式中，通过向害虫导入dsRNA，可以诱导产生RNAi。本专利技术利用RNAi技术沉默光肩星天牛AglaOrco基因的表达，验证了AglaOrco的基因功能；同时，还可以干扰害虫两性间或与寄主植物间的信息交流，控制害虫种群数量，对科学绿色的害虫防治具有重要意义，也可以为鞘翅目同属昆虫的防治手段提供新的借鉴和参考。
[0013]第三方面，本专利技术提供了一种护林防虫制剂，所述护林防虫制剂包括所述dsRNA。
[0014]第四方面，本专利技术提供了一种护林防虫方法，所述护林防虫方法包括将所述dsRNA导入害虫体内的步骤，所述导入的方法优选包括饲喂法和/或注射法。
[0015]有益效果：
[0016]本专利技术提供了一种靶向光肩星天牛嗅觉共表达受体基因的dsRNA。实验验证：将5ug所述dsRNA(ds
‑
Orco)注射雌雄成虫咽部72h后，经过荧光定量PCR检测可发现注射dsRNA(ds
‑
Orco)处理组雌成虫相比未注射对照组的AglaOrco基因表达下调了68％，注射dsRNA(ds
‑
Orco)处理组雄成虫下调了85％，有效的干扰了基因的表达。触角电位反应的结果显示，注射5ug/头dsRNA(ds
‑
Orco)处理72h的雌成虫对寄主植物挥发物3
‑
蒈烯和罗勒烯的电位反应显著下降；雄成虫对寄主植物挥发物3
‑
蒈烯，罗勒烯和雌性接触性信息素成分之一(Z)
‑9‑
二十三碳烯的电位反应显著下降，说明本专利技术提供的dsRNA可干扰光肩星天牛雌雄成虫在两性间和寄主植物之间的嗅觉识别和信息交流过程，阻断其正常两性交配和寄主取食过程。
[0017]本专利技术还提供了一种环境友好、高效科学的害虫防治方法，为光肩星天牛的全面防控工作提供了基础。
附图说明
[0018]为了更清楚地说明本专利技术或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行说明。
[0019]图1是本专利技术实施例1中光肩星天牛共表达受体基因AglaOrco的全长基因克隆电泳图；
[0020]图2是本专利技术实施例3中光肩星天牛共表达受体AglaOrco基因沉默效果的检测结果图；图2中A图为注射dsRNA光肩星天牛雌成虫AglaOrco基因表达水平图；图2中B图为注射dsRNA光肩星天牛雄成虫AglaOrco基因表达水平图；
[0021]图3是本专利技术实施例4中光肩星天牛雌雄成虫对气味分子的反应图；图3中A图为注射dsRNA光肩星天牛雌成虫对壬醛，乙酸乙酯，3
‑
蒈烯，罗勒烯和4
‑
庚氧基
‑1‑
丁醇的电位反应图；B图为注射dsRNA光肩星天牛雄成虫对α
‑
蒎烯，乙酸乙酯，3
‑
蒈烯，罗勒烯和(Z)
‑9‑
二十三碳烯的电位反应图。
具体实施方式
[0022]下面结合实施例对本专利技术提供的技术方案进行详细说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。若未特别指明，实施例中所使用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等均可从商业途径得到。
[0023]实施例1光肩星天牛共表达受体AglaOrco基因全长克隆
[0024]提取光肩星天牛雌雄成虫触角总RNA，使用反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa)合成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板，根据光肩星天牛AglaOrco基因的编码区序列的两侧设计引物，正向引物：5
’‑
ATGATGAAATTCAAGGTATC
‑3’
(SEQ ID No.4)；反向引物：5
’‑
TTATTTGAGTTGCACCAACAC
‑3’
(SEQ ID No.5)。
[0025]PCR反应体系为2*p本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.靶向光肩星天牛嗅觉共表达受体基因的dsRNA，其特征在于，所述dsRNA以如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为模板，采用dsRNA合成试剂盒合成。2.根据权利要求1所述靶向光肩星天牛嗅觉共表达受体基因的dsRNA，其特征在于，所述dsRNA的核苷酸序列包括SEQ ID No.3，或，SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能的编码核苷酸序列。3.权利要求1或2所述dsRNA，或者包括SEQ ID No.1所示核苷酸序列的光肩星天牛嗅觉共表达受体AglaOrco基因在防治害虫中的应用。4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述害虫包括光肩星天牛成虫。5.根据权利要求3或4所述应用，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶静，张赛男，宗世祥，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：