一种基于CRISPR技术检测病原微生物的方法技术

本发明专利技术提供了一种基于CRISPR技术检测布鲁氏杆菌或布鲁氏菌病的方法，所述方法包括利用gRNA、Cas蛋白和单链核酸检测器进行检测的步骤；本发明专利技术通过对gRNA的筛选和优化，提高了检测效率，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR技术检测病原微生物的方法


[0001]本专利技术涉及核酸检测领域，尤其涉及基于CRISPR技术检测布鲁氏杆菌的方法、系统和试剂盒。

技术介绍

[0002]传染性鼻气管炎(Bovine infectious rhinotracheitis)，又称坏死性鼻炎、红鼻病，是由I型牛疱疹病毒(Bovine herpesvirus type 1)引起牛的一种接触性传染病，表现上呼吸道及气管黏膜发炎、呼吸困难、流鼻汁等症状，BHV
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1还可引起生殖道感染、结膜炎、脑膜脑炎、流产、乳房炎等多种病症。该病被OIE列为B类传染病，也被我国列为二类动物传染病。目前国内外用于诊断I型牛疱疹病毒的检验方法包括：病毒分离、包涵体检查、免疫荧光试验、血清中和试验、间接血凝试验或酶联免疫吸附试验等。近年来，检测病毒DNA的核酸探针技术、聚合酶链反应(PCR)技术也已建立。在国际贸易中，指定诊断方法为病毒中和试验、酶联免疫吸附试验和病原分离鉴定(仅限于精液)。
[0003]病毒性腹泻/粘膜病(Viral Diarrhea/Mucosal Disease)，是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea/Mucosal Disease Virus)引起的传染病，以粘膜发炎、糜烂、坏死和腹泻为特征。家养和野生的反刍兽及猪是本病的自然宿主，自然发病病例仅见于牛，黄牛、水羊、牦牛，没有明显的种间差异。各种年龄的牛都有易感性，但6
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18月龄的幼牛易感性较高，感染后更易发病。绵羊、山羊也可发生亚临诊感染，感染后产生抗体。牛病毒性腹泻病毒的检测方法有很多，包括血清中和试验、免疫组化方法、ELISA和荧光PCR技术。也有利用CRISPR
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Cas13a检测牛病毒性腹泻病毒的报道(例如，中国专利申请CN111979357A)，但是检测耗时较长，并且，其检测的是RNA，应用场景有限。
[0004]布鲁氏菌病(Brucellosis)，又称布病、地中海弛张热、马耳他热、波浪热，是一种人畜共患性全身传染病。布病主要损害人、畜的生殖系统和关节，对畜牧业的发展以及人类健康产生了较大的危害。布鲁氏菌病的病原菌为布鲁氏杆菌(Brucella)。布鲁氏菌病病畜诊断标准如下：
①
分离出布鲁氏杆菌。
②
血清学正式试验中试管凝集试验阳性或补体结合试验阳性。
③
初筛试验中，一项或多项出现阳性，并有流行病学史和临床症状者。一般牲畜具备上述一项者即判定为病畜。目前已经有采用Cas12a检测布鲁氏杆菌的方法，如中国专利申请CN112322764A，但是检测耗时较长，检测灵敏度低。
[0005]本专利技术提供了一种新型的检测I型牛疱疹病毒、或牛病毒性腹泻病毒、或布鲁氏杆菌的方法，该方法是基于CRISPR技术，尤其是基于V型Cas酶的trans活性，提供的一种快速简便、特异性高、检测灵敏度高的检测方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种基于CRISPR技术进行I型牛疱疹病毒、或牛病毒性腹泻病毒、或布鲁氏杆菌检测的方法、系统和试剂盒。
[0007]一方面，本专利技术提供了一种用于检测I型牛疱疹病毒的gRNA，所述gRNA包括与Cas
蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列，所述靶核酸为来源于I型牛疱疹病毒的核酸。
[0008]本专利技术中，所述与CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域又称为同向重复序列、骨架区或spacer序列，该区域与Cas蛋白相互作用，从而结合Cas蛋白。
[0009]在一个实施方式中，所述gRNA自5
’
端至3
’
端依次包括与Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列。
[0010]在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列含有20
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30个碱基，并且与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交，并且所述导向序列包含SEQ ID No.5
‑
8任一所示的序列；优选的，所述导向序列包含SEQ ID No.5、6、7、8任一所示的序列。
[0011]在优选的实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列含有20
‑
30个碱基，例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基。
[0012]在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列包含SEQ ID No.5
‑
8任一所示的序列，并且在SEQ ID No.5
‑
8任一所示的序列的3
’
端还包括1
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10个碱基(优选，1、2、3、4、5、6、7、8、9个碱基)，并且，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交；优选的，所述导向序列包含SEQ ID No.5、6、7、8任一所示的序列。
[0013]在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.5
‑
8任一所示的序列相比，在SEQ ID No.5
‑
8任一所示的序列的3
’
端连续缺失1
‑
5个碱基(例如，1、2、3、4、5个碱基)。
[0014]所述与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交，是指上述导向序列与SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的反向互补序列的连续的一段可以连续的互补配对。比如，所述与靶核酸杂交的导向序列含有30个碱基，则，导向序列的30个碱基需要与SEQ ID No.1或其互补序列的连续30个碱基互补配对。
[0015]在更优选的实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列如SEQ ID No.5
‑
8任一所示。
[0016]在一个实施方式中，所述Cas蛋白选自V型Cas蛋白，例如，Cas12、Cas14家族蛋白或其突变体。
[0017]在一个实施方式中，所述Cas蛋白优选为Cas12家族，包括但不限于Cas12a、Cas12b、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12j中的一种或任意几种。
[0018]优选的，所述与Cas蛋白结合的区域的序列如SEQ ID No.21所示。
[0019]另一方面，本专利技术提供了一种检测/诊断I型牛疱疹病毒的组合物，所述组合物包括上述gRNA，还包括Cas蛋白以及单链核酸检测器。
[0020]另一方面，本专利技术提供了一种检测/诊断I型牛疱疹病毒或传染性鼻气管炎的方法，所述方法包括将待测核酸与V型Cas蛋白、上述gRNA和单链核酸检测器接触；检测由Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测I型牛疱疹病毒或传染性鼻气管炎。
[0021]进一步的，所述方法还包括从待测样品中获得待测核酸的步骤；优选的，采用扩增的方法从待测样品中获得待测核酸。
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测布鲁氏杆菌的gRNA，所述gRNA包括与V型Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列，所述靶核酸为来源于布鲁氏杆菌的核酸；其特征在于，所述与靶核酸杂交的导向序列选自下组任意一种或其组合：(1)所述与靶核酸杂交的导向序列含有20
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30个碱基，并且与SEQ ID No.3所示的序列或其反向互补序列杂交，并且所述导向序列包含SEQ ID No.11
‑
20任一所示的序列；(2)所述与靶核酸杂交的导向序列包含SEQ ID No.11
‑
20任一所示的序列，并且在SEQ ID No.11
‑
20任一所示的序列的3
’
端还包括1
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10个碱基，并且，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.3所示的序列或其反向互补序列杂交；(3)所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.11
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20任一所示的序列相比，在SEQ ID No.11
‑
20任一所示的序列的3
’
端连续缺失1
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5个碱基；(4)所述与靶核酸杂交的导向序列如SEQ ID No.11
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20任一所示。2.一种检测布鲁氏杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丽梅，梁亚峰，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：