【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复(crispr)。具体而言，本专利技术涉及一种降低脱靶效率的cas蛋白及其应用。
技术介绍
1、crispr/cas技术是一种被广泛使用的基因编辑技术，它通过rna引导对基因组上的靶序列进行特异性结合并切割dna产生双链断裂，利用生物非同源末端连接或同源重组进行定点基因编辑。
2、crispr/cas9系统是最常用的ii型crispr系统，它识别3’-ngg的pam基序，对靶标序列进行平末端切割。crispr/cas type v系统是一类新发现的crispr系统，它具有5’-ttn的基序，对靶标序列进行粘性末端切割，例如cpf1，c2c1，casx，casy。然而目前存在的不同的crispr/cas各有不同的优点和缺陷。例如cas9，c2c1和casx均需要两条rna进行指导rna，而cpf1只需要一条指导rna而且可以用来进行多重基因编辑。casx具有980个氨基酸的大小，而常见的cas9，c2c1，casy和cpf1通常大小在1300个氨基酸左右。此外，cas9，cpf1，casx，casy的pam序列都比较复杂多样，而c2c1识别严谨的5’-ttn，因此它的靶标位点比其他系统容易被预测从而降低了潜在的脱靶效应。
3、中国专利技术专利cn111757889b中公开了一种cas蛋白cas12f.4，还公开了该蛋白可以在真核细胞中进行基因编辑，但是，存在潜在的脱靶效应，本申请对该蛋白进行了优化，降低了其在基因编辑过程中的脱靶效应。
>技术实现思路
1、本申请的专利技术人经过大量实验和反复摸索，通过对cas12f.4(本申请中将其称之为，cas12i3或cas12i.3)蛋白的定点突变，提高了其编辑活性，降低了其在基因编辑过程中的脱靶效应，扩展了其应用范围。
2、cas效应蛋白
3、一方面，本专利技术提供了一种脱靶效应降低的cas突变蛋白，所述突变蛋白与亲本cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于seq id no.1所示氨基酸序列的以下氨基酸位点处存在突变：第876位和/或第890位。
4、在一个实施方式中，所述cas突变蛋白在上述第876位氨基酸位点存在突变；进一步的，在第876位氨基酸突变的基础上，还包括第890位氨基酸位点突变。
5、在一个实施方式中，所述cas突变蛋白在上述第890位氨基酸位点存在突变；进一步的，在第890位氨基酸突变的基础上，还包括第876位氨基酸位点突变。
6、在一个实施方式中，所述第876位氨基酸突变为非d的氨基酸，例如，a，v，g，l，q，f，w，y，n，s，e，k，m，t，c，p，h，r，i；优选，r。
7、在一个实施方式中，第890位氨基酸突变为非a的氨基酸，例如，d，v，g，l，q，f，w，y，n，s，e，k，m，t，c，p，h，r，i；优选，r。
8、进一步的，所述cas突变蛋白与亲本cas蛋白的氨基酸序列相比，还在对应于seqid no.1所示氨基酸序列的下述任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第7位、第233位、第267位、第369位、第433位。
9、在一个实施方式中，所述第7位氨基酸突变为非s的氨基酸，例如a，v，g，l，q，f，w，y，d，k，e，n，m，t，c，p，h，r，i；优选，r、h、k、m、f、p、a、w、i、v、l、q、c或y，优选，r。
10、在一个实施方式中，所述第233位氨基酸或第267位氨基酸突变为非d的氨基酸，例如，a，v，g，l，q，f，w，y，n，s，e，k，m，t，c，p，h，r，i；优选，所述第233位氨基酸或第267位氨基酸突变为r。
11、在一个实施方式中，所述第369位氨基酸突变为非n的氨基酸，例如，a，v，g，l，q，f，w，y，d，s，e，k，m，t，c，p，h，r，i；优选，r。
12、在一个实施方式中，第433位氨基酸突变为非s的氨基酸，例如，a，v，g，l，q，f，w，y，d，n，e，k，m，t，c，p，h，r，i；优选，r。
13、在一个实施方式中，所述第876位氨基酸突变为非d的氨基酸，例如，a，v，g，l，q，f，w，y，n，s，e，k，m，t，c，p，h，r，i；优选，r。
14、在一个实施方式中，所述第890位氨基酸突变为非a的氨基酸，例如，d，v，g，l，q，f，w，y，n，s，e，k，m，t，c，p，h，r，i；优选，r。
15、在一些实施方案中，所述亲本cas蛋白为天然野生型cas蛋白；在其他的实施方式中，所述亲本cas蛋白为经过工程化改造后的cas蛋白。
16、来自多种生物体的cas蛋白或cas12i蛋白都可以用作亲本cas蛋白，在一些实施方式中，所述亲本cas蛋白或cas12i蛋白具有核酸酶活性。在一些实施方案中，所述亲本cas蛋白是核酸酶，即切割靶双螺旋核酸(例如，双螺旋dna)的两条链。在一些实施方案中，所述亲本cas蛋白是切口酶，即切割靶双螺旋核酸(例如，双螺旋dna)的单链。
17、在一个实施方式中，所述亲本cas蛋白为cas12家族的cas蛋白，优选，cas12i家族的cas蛋白，例如，cas12i1、cas12i2、cas12i3等。
18、在一个实施方式中，所述cas12家族的cas蛋白的氨基酸序列与seq idno.1相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％或100％的序列同一性。
19、在一个实施方式中，所述亲本cas蛋白的氨基酸序列与seq id no.1相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同一性。
20、在一个实施方式中，所述cas突变蛋白选自以下i-iii任意一组：
21、i、由seq id no.1所示氨基酸序列在包含以下任一或任意几个氨基酸位点处产生突变得到的cas突变蛋白：第876位、第879位；任选的，所述cas突变蛋白还在seq id no.1所示氨基酸序列的以下任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第7位、第233位、第267位、第369位、第433位；
22、ii、与i所述的cas突变蛋白相比，具有i中所述的突变位点；并且，与i所述的cas突变蛋白相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种Cas突变蛋白，所述突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQID No.1所示氨基酸序列的以下氨基酸位点处存在突变：第876位和/或第890位；优选的，所述Cas突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，还在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的下述任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第7位、第233位、第267位、第369位、第433位；更优选的，所述亲本Cas蛋白来源于Cas12家族蛋白。
2.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括权利要求1所述的Cas突变蛋白以及其他的修饰部分。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为编码权利要求1所述Cas突变蛋白的多核苷酸序列，或编码权利要求2所述融合蛋白的多核苷酸序列。
4.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求3所述的多核苷酸以及与之可操作连接的调控元件。
5.一种CRISPR-Cas系统，其特征在于，所述系统包括权利要求1所述的Cas突变蛋白以及至少一种gRNA；
6.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含：
7.一种工程
8.权利要求1所述的Cas突变蛋白，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求4所述的载体，或权利要求5所述的CRISPR-Cas系统，或权利要求6所述的组合物，或权利要求7所述的宿主细胞在选自如下任一或任意几种中的应用：
9.一种编辑靶核酸、靶向靶核酸或切割靶核酸或降低基因编辑中脱靶效率的方法，所述方法包括将靶核酸与权利要求1所述的Cas突变蛋白，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求4所述的载体，或权利要求5所述的CRISPR-Cas系统，或权利要求6所述的组合物，或权利要求7所述的宿主细胞进行接触。
10.一种用于基因编辑、基因靶向或基因切割或降低基因编辑中脱靶效率的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的Cas突变蛋白，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求4所述的载体，或权利要求5所述的CRISPR-Cas系统，或权利要求6所述的组合物，或权利要求7所述的宿主细胞。
...【技术特征摘要】
1.一种cas突变蛋白，所述突变蛋白与亲本cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于seqid no.1所示氨基酸序列的以下氨基酸位点处存在突变：第876位和/或第890位；优选的，所述cas突变蛋白与亲本cas蛋白的氨基酸序列相比，还在对应于seq id no.1所示氨基酸序列的下述任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第7位、第233位、第267位、第369位、第433位；更优选的，所述亲本cas蛋白来源于cas12家族蛋白。
2.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括权利要求1所述的cas突变蛋白以及其他的修饰部分。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为编码权利要求1所述cas突变蛋白的多核苷酸序列，或编码权利要求2所述融合蛋白的多核苷酸序列。
4.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求3所述的多核苷酸以及与之可操作连接的调控元件。
5.一种crispr-cas系统，其特征在于，所述系统包括权利要求1所述的cas突变蛋白以及至少一种grna；
6.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含：
7.一种工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求1所述的cas突...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁亚峰，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。