用于检测蛋白质和核酸的纳米孔生物传感器制造技术

本文涉及基于修饰的溶细胞素蛋白质的纳米孔生物传感器。所述纳米孔生物传感器容纳包括蛋白质和核酸的大分子，并且可以额外地包括具有选择性结合性质的配体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及基于修饰的溶细胞素蛋白质的纳米孔生物传感器。所述纳米孔生物传 感器容纳大分子，所述大分子包括折叠的蛋白质和核酸，所述核酸包括双链（ds)DNA，所述 纳米孔生物传感器与其他纳米孔生物传感器相比，显示出增强的活性，溶解性和电性质。
技术介绍
离子或分子穿过生物膜的运输是细胞生命的基本过程，且所述运输被离子通 道，转运蛋白（transporter)和孔紧密地调节。最近，研究者在单分子分析中采用生物 的，1固态的， 2DNA折纸3和混合的3a'b'4纳米孔。5生物纳米孔与它们的合成对应物相比 具有优势，主要是因为它们可以重复制造并以人工纳米孔无法匹敌的原子水平精度修 饰。然而，生物纳米孔仍有缺点。生物纳米孔的机械稳定性取决于具体情况。来自金黄 色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)的α溶血素（aHL)纳米孔和来自耻垢分枝杆菌 (Mycobacteriumsmegmatis)的孔蛋白A(MspA)纳米孔在脂类双分子层中在高施加电势下 保持打开，而且令人惊讶的是能很好地对抗温度，6pH6M和变性剂浓度的极端条件。&'8然 而，多数其他孔蛋白和通道不太牢固。然而，可认为地，生物纳米孔最大的不利条件是其固 定的尺寸。例如，aHL，MspA或气单胞菌溶素纳米孔的尺寸允许对单链核酸、适配子或小肽 进行分析，9但是它们较小的内直径（~lnm)妨碍了对其他重要生物系统例如折叠的酶或 核酶的直接研究。 最近大量的研究对折叠蛋白质迀移穿过人工纳米孔进行了采样。w然而，对具有固 态纳米孔的蛋白质的研究是困难的，因为蛋白质具有不均匀的电荷分布，它们经常吸附到 纳米孔表面而且它们太快迀移而不能合适地取样。&进一步地，由于蛋白质具有紧密折叠 结构，纳米孔的直径应该与蛋白质的直径相似。最近，我们已经介绍了作为第一生物纳米 孔的来自伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphi)的溶细胞素A(ClyA)，其能够对天然折叠蛋白 质进行研究。7aClyA结构对于这项任务是理想的，因为蛋白质例如凝血酶（37kDa)或苹果 酸脱氢酶（二聚体，35kDa单体）可在宽的顺式入口（5.5nm，表1)和窄的反式出口（3.3nm， 表1)之间被电泳捕获，并可因此采样若干分钟。因为离子电流穿过ClyA对于前庭环境非 常敏感，因此人和牛的凝血酶的阻断可以非常容易被识别。7a我们的工作是基于ClyA结构， 所述ClyA结构中，ClyA-WT(C87和C285)的两个天然半胱氨酸残基被丝氨酸（ClyA-SS)取 代。7a然而，当与ClyA-WT单体相比时，ClyA-SS单体显示低的水溶解性和低活性（图S1)， 且在施加的电势高于+60mV或低于-90mV时，ClyA-SS单体在平面脂类双分子层中自发地 打开和关闭（门控（gated))。 因此，现有技术中仍需要具有对目标分析物的高灵敏度和在电势范围内具有高水 溶性和稳定性的纳米孔生物传感器。所述纳米孔生物传感器应具有良好的寡聚性、电压依 赖型门控性和在单通道电流记录中的电噪音性能。本专利技术涉及工程纳米孔，与ClyA-WT和 ClyA-SS相比，在所述纳米孔中对天然半胱氨酸残基和其他残基的特定取代赋予了其额外 的性质。
技术实现思路
本专利技术的一个方面涉及包含多个亚基的修饰的ClyA孔，其中每个亚基包含由与 SEQIDN0:1至少80%相同的氨基酸序列表示的多肽，其中精确地只有一个Cys残基被Ser取代。在一些实施方式中，Cys残基是C285。在某些实施方式中，修饰的ClyA孔的每个亚 基包括至少一个额外的选自L99Q，E103G，F166Y和K294R的氨基酸取代基。例如，每个亚基 可以包含由SEQIDN0:2的氨基酸序列表示的多肽。在某些实施方式中，在每个亚基中精 确地只有一个Cys残基被Ala取代。在一些实施方式中，修饰的ClyA孔的每个亚基包括 至少一个额外的选自L203V和H207Y的氨基酸取代基。例如，每个亚基可以包含由SEQID NO:3的氨基酸序列表示的多肽。 在一些实施方式中，修饰的ClyA孔包含至少12个亚基。例如，修饰的ClyA孔可 以包含12个亚基或者可以包含13个亚基。在某些实施方式中，修饰的ClyA孔具有至少 3. 5nm的顺式直径。在某些实施方式中，修饰的ClyA孔具有至少6nm的反式直径。在一些 实施方式中，当穿过修饰的ClyA孔的电压范围从-60+90到-150mV时，修饰的ClyA孔保持 打开。 在一些实施方式中，蛋白质分析物结合到修饰的ClyA孔的内腔中。蛋白质分析物 可以结合到修饰的ClyA孔的内腔中的多于一个的位点。在一些实施方式中，蛋白质分析物 是一种具有15_70kDa分子量范围的蛋白质。【附图说明】 图1显示了由来自大肠杆菌ClyA结构的同源建模构造的伤寒沙门氏菌ClyA纳米 孔（PDB:2WCD，90%序列同一性）的条带代表图。17在图la中，1个原体突出显示，其次级 结构元素从N至C端用深灰色遮蔽，其它原体以浅灰色交替显示。通过定向进化实验改变 的氨基酸的侧链以球形展示。两个天然半胱氨酸残基和苯丙氨酸166被标记。图lb表明 了ClyA-SS、ClyA-CS和ClyA-AS相对于ClyA-WT的序列变化。 图2显示了ClyA-WT，ClyA-SS和进化的ClyA变体的寡聚化和纳米孔的形成。图 2a显示了ClyA纳米孔的寡聚，所述寡聚通过4-20%的BN-PAGE检测。蛋白质（lmg/ml)在 负载到凝胶中之前用0.5%DDM在室温预孵化30分钟（40μg/泳道）。泳道1:蛋白质梯 度，泳道 2:ClyA-WT，泳道 3:ClyA-SS，泳道 4:ClyA-AS，泳道 5:ClyA-CS。图lb显示了单一 的纳米孔电导分布，其是由ClyA-WT纳米孔（顶部），ClyA-CS纳米孔（中间）和ClyA-AS 纳米孔（底部）在〇. 5%DDM中预寡聚之后的平面脂质双分子层中重新构成的100个纳米 孔获得。在_35mV，15mMTris.(三羟甲基氨基甲烷）HCl，pH7. 5, 150mMNaCl中进行记录， 温度为28°C。 图3显示了 62个ClyA-CS纳米孔的单一电导，所述纳米孔是从在4-20 %丙烯酰胺 BN-PAGE上分离的ClyA-CS的最低（图3a)，第二最低（图3b)和第三最低（图3c)的寡聚 带中提取出的。ClyA-CS单体在0. 5%DDM中预孵化并负载到图2所描述的BN-PAGE上。切 除的带被方框框住并在插图上用箭头标注。在_35mV，28°C的pH= 7. 5的包含150mMNaCl 的15mMTris.HCl中进行记录。 图4显示了在三种类型的ClyA-CS纳米孔上由HT引发的电流阻塞。在图4a中，从 左到右，穿过I型，II型和III型ClyA纳米孔（灰色），各所述纳米孔的前庭中包含HT(黑）。II型和III型ClyA纳米孔如在补充信息中所述的被建模为13聚体（13mer) (II型）或14 聚体（III型）。图4b显示了 -35mV时对I型（左），II型（中）或III型（右）ClyA-CS 纳米孔的HT阻塞。对I型和II型ClyA-CS的HT电流阻塞在LI(IRES%分别=56本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含多个亚基的修饰的ClyA孔，其中每个亚基包含由与SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列表示的多肽，其中精确地只有一个Cys残基被Ser取代。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔瓦尼·马利亚，米哈埃·索斯金尼，
申请(专利权)人：鲁汶天主教大学，
类型：发明
国别省市：比利时;BE