反义分子和治疗疾病的方法技术

一种能在肌营养不良蛋白基因中结合所选靶点诱导外显子跳跃的反义分子，如下序列所述，SEQ?ID?NO：1至59。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及适于促进外显子跳跃的新型反义化合物和组合物。利用适合用于本专利技术方法的反义化合物和治疗组合物，本专利技术也提供了诱导外显子跳跃的方法。
技术介绍
下述
技术介绍
讨论只是为了便于理解本专利技术。该讨论并不承认或认为引用的任何材料在本申请优先权日时是或曾经是公共知识的一部分。目前，科研人员正付出巨大努力研究抑制或弥补疾病引起的基因突变的方法。反义技术正在开发之中，利用一系列的化学物质在多种不同水平上(转录、剪接、稳定、翻译) 影响基因表达。该研究大多聚焦于使用反义化合物纠正或弥补各种不同疾病中异常或与疾病有关的基因。反义分子能够精确特异性地抑制基因表达，正因为如此，关于寡聚核苷酸作为基因表达调节物的许多研究都聚焦于抑制如原癌基因或病毒基因等靶基因的表达。这些反义寡核苷酸或抑制RNA (正义链)，或通过与DNA形成三螺旋结构，抑制RNA聚合酶II的转录， 来抑制DNA。为了获得特定基因下调的预期效应，寡核苷酸必须促进靶mRNA的衰减或阻断 mRNA的翻译来有效阻止非预期靶蛋白的从头合成。当目标是使天然蛋白产物上调、或者用来弥补无义突变或移码突变引起翻译提前终止时，这类技术就没有作用了。此外，由于突变使得正常功能蛋白过早失效的情况，利用反义技术，通过剪接加工 期间的干预作用，来恢复一些功能蛋白产物的方法已成为可能。(Sierakowska H, et al., (1996)Proc Natl Acad Sci USA 93, 12840-12844 ；ffilton SD,et al. , (1999) Neuromusc Disorders 9,330-338 ；van Deutekom JC et al. , (2001)Human Mol Genet 10，1547-1554)。在这些情况下，有缺陷的基因转录物不应当被靶向降解，因此反义寡核苷酸化合物不应当促进祀mRNA的衰减。在各种遗传疾病中，突变对基因最后表达的影响可通过剪接加工期间靶向的外显子跳跃过程进行调节。剪接加工通过复杂的多粒子剪接体定向，该剪接体将mRNA前体 (Pre-mRNA)中毗邻的外显子-内含子结点紧靠，并将内含子末端的磷酸二酯键断裂，随后在外显子之间进行重排从而剪接在一起。这个复杂且高度精确的过程通过mRNA前体中的序列基元调节，序列基元是相对短的半保守RNA片段，其能与剪接反应中有关的各种核剪接因子结合。通过改变剪接体读取或识别mRNA前体过程中有关的基序的方式，可创造出不同的被剪接mRNA分子。现已知大多数人类基因在正常基因表达期间可替代性剪接，尽管涉及的机制还没有明确。现已显示，利用反义寡核苷酸，可从成熟的基因转录中绕过或去除编码mRNA中的错误和缺陷。自然情况下，剪接加工中遗传缺失或外显子跳跃的程度并不完全为人所知，尽管已记录了许多实例，通常以极低水平发生(Sherrat TG, et al. , (1993) Am J Hum Genet53，1007-1015)。但是，现已明确假如与引起疾病突变有关的外显子可以特异性地从某些基因上缺失，有时候可以产生较短的蛋白产物，该蛋白产物具有与天然蛋白相似的生物学性质，或者具有足够的生物学活性以改善与靶外显子有关的突变引起的疾病(Lu QL, et al. , (2003)Nature Medicine9, 1009-1014 ；Aartsma-Rus A et al. , (2004)Am J Hum Genet 74:83-92)。靶向于外显子跳跃的过程可能在长基因中特别有用，长基因中具有许多外显子和内含子，其中外显子的遗传组成上具有冗余，或者一个蛋白可以具有功能而不需要一个或多个特定的外显子(例如肌营养不良蛋白基因有79个外显子组成；或者可能有些胶原蛋白基因编码重复的序列块，或者巨大的伴肌动蛋白或肌联蛋白基因分别由-80和超过370个外显子组成)。各种基因中的突变引起了截短，利用基因改造治疗与该截短有关的遗传疾病，该基因改造有关的研究工作主要集中于利用反义寡核苷酸(I)与剪接加工中涉及的元件部分或完全重叠；或(2)在非常靠近元件的位点结合mRNA前体，以阻断剪接因子的结合和功能，正常情况下，剪接因子可调节发生在上述元件上的特定剪接反应(例如在待阻断元件的3、6或9核苷酸位点结合mRNA前体)。例如，现已报道了体外和体内中利用反义寡核苷酸调节突变肌营养不良蛋白mRNA前体的剪接。在由日本报道的一类肌营养不良蛋白突变中，52-碱基对的缺失突变导致剪接加工中去除了外显子19与侧翼内含子(Matsuo et al. , (1991) J Clin Invest. 87:2127-2131)。体外小基因剪接系统已用于显示31部分2’ -O-甲基寡核糖核苷酸与肌营养不良蛋白Kobe外显子19中缺失序列的5’端互补，抑制了野生型mRNA前体的剪接(Takeshima et al. (1995)，J. Clin.1nvest. 95:515-520)。在人体培养的成淋巴细胞样中，相同的寡核苷酸用于从天然肌营养不良蛋白基因转录物中诱导外显子跳跃。Dunckley et al. (1997)Nucleosides & Nucleotides, 16，1665-1668 描述了用于体外构建体，该体外构建物用于分析mdx小鼠突变种中突变肌营养不良蛋白的外显子23周围的剪接，mdx小鼠突变种是一种肌营养不良症模型。尽管没有给出靶点或序列，但对体外利用2’修饰的寡核苷酸分析这些构建体的计划进行了讨论，所述寡核苷酸靶向作用于剪接位点，剪接位点位于小鼠肌营养不良蛋白外显子23之内或与之紧邻。随后报道了 2’-0_甲基寡核糖核苷酸能纠正这类mdx小鼠肌细胞中的肌营养不良蛋白缺陷。靶向作用于鼠肌营养不良蛋白内含子223’端剪接位点的反义寡核苷酸也得到报道，该反义核苷酸导致突变外显子和数个两侧外显子发生了跳跃，并产生了具有新型内部缺失的新型结构内(in-frame)肌营养不良蛋白转录物。1_2%反义治疗的mdx小鼠表达了这种突变的肌营养不良蛋白。其他修饰的寡核苷酸如2’-0_甲氧乙基磷酸二酯的应用也有所描述(Dunckley et al. (1998) Human Mol. Genetics, 5:1083-90)。因此，反义分子可以提供一种治疗遗传疾病如杜氏肌营养不良(DMD)的工具。然而，利用反义分子诱导外显子跳跃的尝试结果喜忧参半。Errington et al. (2003) J Gen Med 5:518-527)描述了针对肌营养不良蛋白外显子19的研究，该研究中使用各种反义分子成功将该外显子从肌营养不良蛋白mRNA前体中跳跃出来，所述反义分子靶向作用于两侧剪接位点或所定义外显子内部的基序。与外显子19明显易于跳跃相比，Dunckley等(1998)首次报道了 mdx小鼠中外显子23发生了跳跃，如今被认为只是自然发生了回复突变转录或者只是人为产物，而不是任何真实的反义活性。除了不能持续产生缺失外显子23的转录物，Dunckley等(1998)没有显示任何诱导外显子跳跃的时间过程，或反义寡核苷酸的均匀滴度，以证明剂量依赖效应， 其中外显子跳跃的水平与反义寡核苷酸量的增加或减少相对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.11.12 AU 20099055491.一种能在肌营养不良蛋白基因中结合所选靶点诱导外显子跳跃的反义分子，如下序列所述，SEQ ID NO :1 至 59。2.一种根据权利要求1所述的反义分子，能在肌营养不良蛋白基因外显子5、11、12、17、21、22、24、43-47、49-64、66 和 67 中诱导外显子跳跃。3.一种由两种以上根据权利要求1或2所述的反义分子组成的组合物，能在肌营养不良蛋白基因中结合所选靶点以诱导外显子跳跃。4.一种由两种以上根据权利要求3所述的反义分子的组成的组合物，所述组合物选自表IB05.根据权利要求1至4之一所述的反义分子，能结合所选靶位，其中所述靶位为选自剪接供体位点、剪接受...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯蒂芬·威尔顿，苏·弗莱彻，艾比·亚当斯，佩妮·莫罗里，
申请(专利权)人：西澳大利亚大学，
类型：
国别省市：