一种苹果酸脱氢酶基因RGMDH1及其重组表达载体制造技术

本发明专利技术公开了一种从粘红酵母YM25079中分离的编码苹果酸脱氢酶的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，通过构建重组载体并在大肠杆菌中表达，表达产物具有苹果酸脱氢酶功能，能催化苹果酸转化成草酰乙酸。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种苹果酸脱氢酶基因RGMDH1及其重组表达载体，具体涉及以粘红酵母（Rhodotorula glutinis）YM25079总RNA反转录的cDNA为模板，扩增得到编码苹果酸脱氢酶(MDH)的基因，将其克隆到大肠杆菌表达载体后诱导表达，亲和层析法纯化后得到纯酶，并对该酶进行了酶活测定及酶学性质的相关研究，属于基因工程和酶工程领域。
技术介绍
苹果酸脱氢酶( MDH)广泛分布于生物体内，是一种活性非常强的酶，它催化草酰乙酸盐和苹果酸盐的相互转化反应，与二核苷酸辅酶的氧化还原相关。草酰乙酸盐在许多代谢途径中都有重要作用，包括三羧酸循环、乙醛酸旁路、氨基酸合成、糖原异生等，并维持氧化还原平衡，还能促进胞质和亚细胞器代谢物的交换。依生物体的功能不同、组织差异、细胞内定位的不同其表达种类不同，MDH具有多种同工酶形式。胞质苹果酸脱氢酶(cMDH)存在于细胞胞质内，担负着将NADH转入线粒体的重任，并且还对调控三羧酸循环有作用，同时cMDH还是核酸通路(NACh)复合体的一个组成部分。苹果酸脱氢酶(MDH)广泛分布在动物组织、微生物和植物中。它是一种活性最强的酶，根据亚细胞定位，苹果酸脱氢酶可分为5种类型，存在于乙醛酸体、线粒体、过氧化物体、叶绿体、细胞浆以及锥虫甘油体内。MDH为多聚体酶，是由相同或相似亚基组成的二聚体或四聚体，亚基的分子量为30-35kDa，MDH在医学方面也引起越来越多的关注如利用基因工程疫苗预防人体带绦虫病已是备受关注的研究方向，通过牛带绦虫亚洲亚种MDH基因的生物信息学分析，预测到胞浆型MDH是一个潜在的诊断抗原，这为带绦虫在诊断、药物及疫苗研究中的应用前景提供了重要的线索，在临床诊断中用于多酶分析及疾病的早期诊断，例如用于诊断DIC（弥散性血管内凝血），心肌梗塞，急慢性肝炎等。在食品领域，苹果酸脱氢酶用于有机酸含量的测定，如L-苹杲酸、醋酸、柠檬酸等物质的测定，应用前景广泛。利用MDH底物专一性，还可将其用于拆分D，L-苹果酸酶。总之，MDHs作为生物体中枢代谢途径的关键酶，国内外对其己进行了较为广泛的研究，MDHs同工酶正应用于生物分类、物种分化、遗传变异、物种杂交和个体发育等研究。因此深入了解MDHs的生理生化特性、结构及功能、催化机制，对于酶重组蛋白的表达、纯化及免疫特性分析，探讨生物体中MDHs的代谢作用以及一些疾病的分子致病机制有着重要的意义。同时MDH的应用研究也将会推动MDHs转基因植物及手性药物的进一步发展。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从粘红酵母（Rhodotorula glutinis）YM25079中分离的苹果酸脱氢酶基因RGMDH1，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示或该核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO：1互补的核苷酸序列，该基因序列长为978bp（碱基），该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的多肽或其片段。本专利技术另一目的是提供一种含有所分离的苹果酸脱氢酶基因RGMDH1的重组表达载体，是将SEQ ID NO：1所示基因直接与不同表达载体（质粒、病毒或运载体）连接所构建的重组载体。本专利技术另一目的是提供一种含有该苹果酸脱氢酶基因RGMDH1的重组表达载体或上述重组表达载体的宿主细胞大肠杆菌（Escherichia coli）菌株BL21。用本专利技术所述的核苷酸序列或含有核苷酸序列的重组载体转化宿主细胞可用本领域的技术人员熟知的方法进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，用CaCl2、电穿孔等方法进行。当宿主是真核生物，可选用DNA转染法、显微注射、电穿孔、脂质体包装等方法。本专利技术提供的核苷酸序列是一种高效、特异性的苹果酸脱氢酶基因，可以将其与载体连接后转化至微生物细胞体内生产苹果酸脱氢酶，具有产物特异性高、生产周期短、生产不受场地、气候、季节的影响及利用不同的菌种和培养基适合开发商业化苹果酸脱氢酶等优点；本专利技术应用基因工程技术构建特异性生产苹果酸脱氢酶的转基因大肠杆菌生产苹果酸脱氢酶，具有操作简单、成本低、可行性高等优点，为苹果酸脱氢酶基因工程化生产奠定基础。附图说明图1为利用本专利技术的粘红酵母YM25079苹果酸脱氢酶基因RGMDH1构建的大肠杆菌重组表达质粒pET32aRGMDH1质粒图谱；图2为本专利技术的苹果酸脱氢酶基因RGMDH1诱导表达并纯化后的SDS-PAGE分析图，其中：1为蛋白电泳Marker；2为转化了pET32a(+)并经IPTG诱导的大肠杆菌BL21总蛋白；3为转化了pET32aRGMDH1并经IPTG诱导的大肠杆菌BL21总蛋白；4为纯化的目的蛋白条带。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步详细说明，但本专利技术保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。实施例1：粘红酵母苹果酸脱氢酶基因RGMDH1的克隆采用OMEGA试剂盒E.Z.N.A Fungal RNA Kit从粘红酵母（Rhodotorula glutinis）YM25079中提取总RNA，用反转录试剂盒Thermo Scientific Maxima H Minus FirstStrand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，取1μl为模板进行聚合酶链式反应。设计引物（引物1和引物2）进行PCR 扩增，反应所用引物、组分和扩增条件如下：引物P1：RGMDHF1: 5`-ATGGGCCTCAAGACTGCTGTTCTC-3` （SEQ ID NO:3）引物P2：RGMDHR1: 5`-TTACTGCTTCATGAAGTTCTGAC-3` （SEQ ID NO:4）PCR扩增体系（50 μL）组成如下：5×Trans PFU Buffer 10μLdNTP（2.5μmol/L） 5μLcDNA 1μLRGMDHF1（10μmol/L） 2μLRGMDHR1（10μmol/L） 2μLFast Pfu DNA polymerase（5U/μL） 2μL无菌ddH2O 补足至50μL；扩增条件：94℃变性4min，再用94℃ 45s、56℃ 45s、72℃ 90s进行30个循环，最后72℃10min，反应完后取产物1μL，然后在浓度为1%的琼脂糖凝胶中，进行电泳分析。经凝胶成像系统成像确认片段大小正确后，用百泰克生物技术有限公司多动能DNA纯化回收试剂盒回收目的片段，然后将PCR扩增得到的目的基因连接到pMD18-T上，连接产物转化大肠杆菌DH5α，用含有氨苄青霉素(Amp+)的LB固体平板进行筛选，挑取平板上的转化子进行菌落PCR筛选阳性克隆，然后送去上海生工测序。测序结果结果显示，获得一段978bp长的序列，命名为RGMDH1，序列组成如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。实施例2：重组表达质粒pET32aRGMDH1的构建采用实施例1中的cDNA为模板进行PCR 扩增，反应所用引物组合、反应组分和扩增条件如下：引物P3：RGMDHF2: 5`-TACGGATCCATGGGCCTCAAGACTGCT -3` （SEQ ID NO:5）引物P4：RGMDHR2: 5`-CGTCTCGAGCTGCTTCATGAAGTTCTG-3` （SEQ ID N本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种苹果酸脱氢酶基因RGMDH1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

【技术特征摘要】
1.一种苹果酸脱氢酶基因RGMDH1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因编码的氨基酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：张琦，王俊，季秀玲，魏云林，林连兵，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南;53