本发明专利技术公开了一种微藻多基因共表达载体，所述表达载体的开放阅读框，采用Ubi启动子、Nos启动子或Hsp70A启动子；目的基因之间以2A肽序列连接并构建在所述表达载体的一个开放阅读框中。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微藻的基因工程领域，尤其是涉及采用小球藻内源性启动子和2A肽 来构建高效表达载体，能够在一个表达框中融合多个基因，转化微藻后实现在微藻中共表 达多个基因产物。
技术介绍
微藻基因工程研究在莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii)中取得了重要 的进展，在三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum)、杜氏盐藻（Dunaliella salina)以及小球藻（Chlorella) 等微藻上也有了不同程度的研究。目前，普遍用于转化的 质粒中表达抗性基因和目的基因启动子是独立的，分别位于不同的表达框里。通过抗性筛 选获得的转化藻不能保证目的基因及其表达框架能够同时整合进基因组，也不能保证其表 达，因此给进一步的鉴定和筛选带来了较大的困难和工作量。此外，对于表达2个及以上目 的基因时，通常需在质粒中同时插入多个表达框，使得质粒骨架变大，对整合效率和目的基 因的表达造成了很大的影响。 利用微藻作为新型生物反应器生产高附加值重组蛋白（蛋白疫苗、治疗性抗体、 工业酶等）的研究已经进行了多年，与其它表达系统相比，微藻具有以下几点优势：1)成本 低，以lg未纯化的蛋白计算，其成本不到用哺乳动物细胞生产的万分之一 ;2)不会受到 病毒和朊病毒的影响，这两者对人体有害，通常由哺乳动物细胞培养引起；3)与细菌和酵 母相比，可以进行复杂的蛋白折叠和修饰，如Mamedov等用质谱分析法对莱茵衣藻糖蛋 白的N端聚糖模式进行了研究，发现其与哺乳动物细胞相似；4)多数种类的微藻是安全的， 即生产的蛋白具有生物相容性，可以不进行纯化。 莱茵衣藻（C.reinhardtii)是真核微藻的模式藻，可以进行自养生长也可以以乙 酸钠为碳源进行混养生长，遗传和代谢背景清楚，三种基因组（核、叶绿体和线粒体）都 可实现外源基因转化，目前被认为是最有潜力的重组蛋白生产平台。但其面临着一个较 大的障碍，即其无论在光自养还是混养培养时的生长速率都较低，培养技术不成熟。 相比较而言，转基因小球藻具有更加明显的优势。小球藻含有丰富的蛋白质、月旨 类、叶绿素、多糖、维生素、微量元素以及一些生物活性代谢产物，营养成分全面而均衡，因 而在保健品、饲料、食品、医药等方面具有巨大的应用价值。与转基因植物相比，小球藻的产 量易于控制，与其它微藻如C. reinhardtii相比，小球藻的繁殖速度要快得多，钱峰慧在 异养培养蛋白核小球藻时发现该藻可耐受高浓度的葡萄糖，在5L和50L生物反应器中培养 90h左右，细胞密度分别可达132. 18g/L和149. 43g/L。小球藻分离纯化表达产物相对简单， 适于规模化生产，且产业化的培养技术已经成熟，小球藻作为食品、营养品等已经被人们广 泛认可。这些优点是其它表达系统和微藻所不具备的，作为新一代的生物反应器，有巨大的 应用潜力。 蛋白核小球藻与一般的实验室研究用微藻不同，它可高产蛋白质、叶黄素和小 球藻生长因子，已于2012年被我国批准为新资源食品。使用独特的异养-稀释-光 诱导串联培养平台技术 (Sequential heterotrophy-dilution-photoinduction cultivation, SHDP)可以实现其高密度高品质的培养，并已经成功实现了蛋白核小球藻粉 的工业化生产，异养培养的平均生长速率达3g/L/d，不低于现有任何其它外源基因表达系 统；此外，在合适的户外培养条件下该藻株可快速固定C02并积累高达40%的油脂，目前 已经用作微藻固碳和微藻能源的工业模式藻株进行产业化开发。基于SHDP技术和高产油 蛋白核小球藻良种，可实现集"高附加值微藻产品、微藻能源和生物固碳"的一体化开发，有 望加快微藻能源和微藻固碳的产业化进程。蛋白核小球藻表达系统的研究和开发在微藻能 源、微藻固碳、废水处理、生物医药、酶制剂、饲料（饵料）添加剂等工业生物
具有 极其重要的应用价值，但迄今未见有关该藻遗传改造方面的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种应用于微藻的多基因共表达的载体，尤其是采用了小 球藻内源性的启动子和具有自我剪切功能的2A肽。 本专利技术提供了一种微藻多基因共表达载体，所述表达载体的开放阅读框，采用Ubi 启动子（Ubiquitin启动子）、AR启动子、Nos启动子或Hsp70A(热激动蛋白70A启动子） 启动子；目的基因之间以2A肽序列连接并构建在所述表达载体的一个开放阅读框中。上述 的启动子可为内源性的或来源自高等植物。所述的表达载体具有其他载体的通用的复制原 点基因和抗性基因，或者无通用的抗性基因，其抗性基因构建入开放阅读框中，与目的基 因一同表达。 其中，优选地，所述Hsp70A启动子和AR启动子与目的基因之间构建有Kozak序列 GCCACC。 其中，优选地，所述的开放阅读框，采用Hsp70A启动子；Hsp70A为蛋白核小球藻内 源性启动子，其序列如SEQ ID NO: 1所示。 优选地，所述的2A肽选自但不限于F2A (肽Foot and mouth disease virus2A)、 T2A 肽(Thosea asigna virus)、P2A 肽(Porcine teschovirus_12A)和 E2A 肽(Equine rhinitis 2A)〇 进一步优选地，所述的F2A肽基因序列如SEQ ID NO: 2所示；所述的T2A肽基因序 列如SEQIDN0:3所示；所述的P2A肽基因序列如SEQIDN0:4所示；所述的E2A肽基因序 列如SEQ ID N0:5所示。 上述表达载体选自 pGreenOOOO、pGreen0029、pBIN19、pBI121、pBI221、 pBluescript SK/KS的重组构建载体。 其中，优选地，所述的表达载体的开放阅读框的终止子为Nos终止子 本专利技术另一方面涉及构多基因共表达微藻，含有上述的构建有抗性基因和目的基 因的多基因共表达载体。 其中，所述的微藻藻种选自蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa)、普通小球 藻（Chlorella vulgaris)、捕圆小球藻（Chlorella ellipsoidea)和小球藻（Chlorella zofingiensis)〇 其中，优选地，所述的抗性基因选自但不限于ble基因（博来霉素抗性基因）、 nptll基因（遗传霉素抗性基因）和hpt基因（潮霉素抗性基因）。 进一步优选地，在构建上述多基因共表达微藻，选用电穿孔法、基因枪法和玻璃珠 法，优选地，选用电穿孔法。 本专利技术提供的载体利用具有自身剪切功能的2A肽，可以实现一个开放阅读框中 表达多个目的基因的效果，与其他共表达的策略相比具有更具明显的优势。【附图说明】 图1为现有载体的开放表达框的结构示意图； 图2为本专利技术所述载体的开放表达框的结构示意图； 图3为本专利技术中涉及的pGreen II 0000-NosT重组质粒的构建流程图； 图4为本专利技术涉及的pGreen II 0000-Npt II-P2A-EGFP-NosT重组质粒的构建流 程图； 图 5 为本专利技术涉及的 pGreen II 0000-Ubi (AR、Hsp)-Npt II-P2A-本文档来自技高网...
【技术保护点】
微藻多基因共表达载体，其特征在于，所述表达载体的开放阅读框，采用Ubi启动子、Nos启动子或Hsp70A启动子；目的基因之间以2A肽序列连接并构建在所述表达载体的一个开放阅读框中。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：范建华，李元广，闰从林，房磊，李淑兰，
申请(专利权)人：华东理工大学，嘉兴泽元生物制品有限责任公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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