本发明专利技术公开了一株高产5‑KGA的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌及其制备方法和应用，（1）将GA2DH基因和PDC基因的上、下游片段分别引入重组整合型自杀质粒，分别得自杀敲除质粒p△GOX1231和p△GOX1081；（2）将p△GOX1231转入宿主菌中，依次经抗生素抗性筛选、无抗培养和蔗糖筛选，然后通过菌落PCR获取GA2DH基因敲除的阳性突变子G.oxydans ZJU1；同样方法将p△GOX1081转入G.oxydans ZJU1中获取PDC基因敲除的阳性突变子G.oxydans ZJU2；（3）将sldAB、pqqABCDE、tldD、P0169及细胞色素bo3氧化酶cyoBACD基因转入步骤（2）所得氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌G.oxydans ZJU2中即得。GA2DH是氧化葡萄糖酸形成2‑KGA的主要酶，而PDC则与催化丙酮酸脱羧，形成乙醛相关，GA2DH和PDC的敲除可以解决5‑KGA形成过程中的代谢分流，减少副产物，实现5‑KGA的高产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种葡萄糖酸杆菌Gluconobacter基因工程菌及其应用，特别是过表 达膜结合山梨醇脱氨酶W及辅酶PQQ和呼吸链末端电子受体，提高5-酬基-D-葡萄糖酸 (5-keto-D-gluconic acid, 5-KGA)的工程菌及应用，属于基因工程和发酵工程
技术介绍
5-酬基-D-葡萄糖酸巧-ket〇-D-gluconic acid, 5-KGA)是一种重要的中间体化 合物。20世纪40年代末期，Gray通过5-KGA合成Vc，并申请专利US2421611，US2421612。 后来又有专利报道5-KGA合成木糖二酸，如US5731467,合成芳香物质4-径基-5-甲 基-2, 3-二径基巧喃酬，如US4464409。更主要的是5-KGA可W通过化学催化制备k (+)-酒 石酸（Journal of American Qiemical Society, 1933, 55, 3563，US2380196，W09615095A1， GB2388368)。氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans) 62IH能耐受高浓度的葡萄 糖，并W葡萄糖为底物，不完全氧化为葡萄糖酸（gluconic acid, GA)，进一步氧化为2-酬 基-D-葡萄糖酸（2-keto-D-gluconic acid, 2-KGA)或者 5-KGA。 德国化lich研究中屯、对Gluconobacter oxydans DSM2343进行基因修 饰，如GASDH基因（葡萄糖酸-S-脱氨酶（gluconate-S-dehy化ogenase)基因）的 失活、GA5DH基因的过表达、表达启动子的改造等，构建工程菌G. oxydans MF1/ pBBRlMCS5-PtufB-ga5化，最终 5-KGA 的产量达 300mM，约 58. 2g/L(Applied Microbiology and Biotechnology, 2006, 73(2), 443-451)。日本山 口大学 Saichana 等筛选到一株耐 热性Gluconobacter,并插入抗性基因失活GA2DH，最终5-KGA产量为190mM，约36. 86g/ L (Applied and Elnviromental Microbiology, 2009, 75 (13), 4240-4247)。浙江大学李 博义等研究G. oxydans CGMCC 1. 637的发酵工艺条件，在恒定抑5. 5,溶氧控制15%的 条件下，流加补葡萄糖，最终5-KGA产量达到75. 5g/l，转化率超过70 % (生物工程学 报，2014, 30巧)，1486-1490);天津科技大学谭之磊等W 2-KGA缺陷型的Gluconobacter oxydans HGI-1为出发菌株，研究碳、氮源对5-KGA合成的影响，化发酵罐中进行分批发酵 放大试验，5-KGA的产量为93. 80g/l，平均生成速率为1. 56g/L ? h。 2005 年 Gluconobacter oxydans 62IH 的基因组序列公布（NC_006677)， 化Uire Biotechnology, 23 (2)，195-200。参与葡萄糖代谢生成5-KGA的2个关键酶分 别是膜结合蛋白葡萄糖脱氨酶（membrane-bound glucose dehy化ogenase,mGDH)和膜 结合山梨醇脱氨酶（membrane-bound sorbitol dehy化ogenase,SLDH)，其均W化咯哇口林 酿（pyrroloquinoline quinone,PQ曲为辅酶，传送电子至呼吸链泛酿（ubiquinone)， 最后经末端电子受体细胞色素b〇3氧化酶（巧toe虹ome b〇3〇xidase)氧化，使电子从泛 酿传递给分子氧，并产生质子梯度电势。2013年，Meyer和Ric化ar化分别研究了辅酶 PQQ及细胞色素b〇3氧化酶在过表达膜结合蛋白时的作用，发现PQQ的量是影响脱氨酶 氧化底物的重要因素，而细胞色素b〇3氧化酶是呼吸链电子传递的限速因子（Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97,3457-3466 ;Journal of Bacteriolo gy, 2013, 195 (18) ,4210-4220)。2013 年，陈坚等申请专利 CN 103484417A，在 G.oxydans WSH-003中表达K. vulgare WSH-001来源的SDH、SNDH和PQQ，一步法从山梨醇生产2-酬 基-k 古龙酸（2-ketoA-gulonic acid, 2-KLG)。同年，天津元英进等在 Ketogulonigenium vulgare中同时表达山梨糖脱氨酶、山梨酬糖脱氨酶W及辅酶PQQ，从山梨糖出发生产 2-KLG(Met油olic Elngineering 2013, 19, 50-56)。
技术实现思路
本专利技术针对现有5-KGA产量低的问题，提供了一株高产5-KGA的氧化葡萄糖杆菌 基因工程菌及其制备方法和应用， 一株高产5-KGA的氧化葡萄糖杆菌基因工程菌的制备方法，包括如下步骤： (1)将GA2DH基因和PDC基因（丙酬酸脱簇酶（pyruvate decarbo巧lase,)基因） 的上、下游片段分别引入重组整合型自杀质粒pJKM的多克隆位点，分别得到GA2DH基因的 自杀型敲除质粒P A G0X1231和PDC基因的自杀型敲除质粒P A G0X1081 ;所述重组整合型 自杀质粒带有SacB基因、抗生素标记和多克隆位点； (2)将所得自杀型敲除质粒PAG0X1231电转化转入宿主菌中，依次经抗生素抗性 筛选、无抗培养和薦糖筛选，然后通过菌落PCR获取GA2DH基因敲除的阳性突变子，命名为 G. oxydans ZJU1 ； (3)将所得自杀型敲除质粒P A G0X1081电转化转入经传代后的G. oxydans ZJU1 中，依次经抗生素抗性筛选、无抗培养和薦糖筛选，然后通过菌落PCR获取PDC基因敲除的 阳性突变子，即得氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，命名为G. oxydans ZJU2 ; (4)将31(148、口9948〔06、11曲、口。169及细胞色素6〇3氧化酶〇7〇84〔0基因转入步骤 (3)所得氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌G. oxydans ZJU2中即得。 W11] 本专利技术在宿主中过表达膜结合山梨醇脱氨酶sldAB基因，W及融合表达辅酶PQQ 基因簇和末端电子受体细胞色素b〇3氧化酶。基于基因无痕体系制备得到基因工程菌 G. oxydans ZJU2,通过控制抑、溶氧，在补料发酵的条件下，5-KGA产量达102g/l，平均生 成速率为1. 7g/L ? h。然而，5-KGA生物合成的产量相对还是比较低，无法满足工业化应用 的要求，比如5-KGA用来催化制备k(+)-酒石酸。为进一步提高5-KGA的产量，本专利技术在 G. oxydans ZJU2基础上，通过基因工程手段构建一株过表达sldAB基因，并同时融合表达 辅酶PQQ及末端电子受体细胞色素b〇3本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株高产5‑KGA的氧化葡萄糖杆菌基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将GA2DH基因和PDC基因的上、下游片段分别引入重组整合型自杀质粒pJKM的多克隆位点，分别得到GA2DH基因的自杀型敲除质粒pΔGOX1231和PDC基因的自杀型敲除质粒pΔGOX1081；所述重组整合型自杀质粒带有SacB基因、抗生素标记和多克隆位点；(2)将所得自杀型敲除质粒pΔGOX1231转入宿主菌中，依次经抗生素抗性筛选、无抗培养和蔗糖筛选，然后通过菌落PCR获取GA2DH基因敲除的阳性突变子，命名为G.oxydans ZJU1；(3)将所得自杀型敲除质粒pΔGOX1081转入经传代后的G.oxydans ZJU1中，依次经抗生素抗性筛选、无抗培养和蔗糖筛选，然后通过菌落PCR获取PDC基因敲除的阳性突变子，即得氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，命名为G.oxydans ZJU2；(4)将sldAB、pqqABCDE、tldD、P0169及细胞色素bo3氧化酶cyoBACD基因转入步骤(3)所得氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌G.oxydans ZJU2中即得。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林建平，袁建锋，朱力，吴绵斌，杨立荣，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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