从氧化葡萄糖杆菌中分离纯化右旋糖酐糊精酶的方法技术

一种从氧化葡萄糖杆菌中分离纯化右旋糖酐糊精酶的方法：首先离心收集菌体，然后用磷酸缓冲液悬浮后，超声波破碎细胞，离心收集上清液。经硫酸鱼精蛋白沉淀、硫酸铵沉淀、疏水层析和凝胶层析后，即可分离得到高纯度的右旋糖酐糊精酶。本发明专利技术方法简便、重复性好且蛋白的得率高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于蛋白纯化领域，具体而言，本专利技术涉及一种。
技术介绍
右旋糖酐(dextran)，又名葡聚糖，是一种由葡萄糖单元脱水形成的高分子聚合 物，作为一种由分泌性酶催化生成的胞外产物，它是世界上最早发现的并较早作为主要血 浆代用品的微生物多糖，其化学结构主要是由葡萄糖的a-l，6-键首尾脱水縮合而成的一 条线形长分子链，在分子结构中含有不同比例的a-l，2、a-l，3及a _1，4_糖苷键的支链， 分子式为(C6H1Q05)n。 右旋糖酐因其安全、无毒、生物相容性好等多种优点，已被广泛应用于医药、食品、 色谱分析等多个领域。右旋糖酐胶体液具有扩充血容量、维持血压的功效，供出血及外伤休 克时急救用，可作为血浆代用品。我国药典1990版将右旋糖酐及其复方制剂列入。临床上 应用的常有三种规格右旋糖酐70、右旋糖酐40、右旋糖酐20。在食品工业中，右旋糖酐因 其持水性、粘稠性，作为低热量食品添加剂，已用于多种饮料和食品的生产。还可代替部分 麦芽糖制作软心巧克力的填充物或添加到啤酒酿造麦芽中去，提高制品的发泡性。在石油 工业中，右旋糖酐可作为油井钻泥添加剂。它也可应用于精细化工，制成交联葡聚糖凝胶， 目前已广泛应用于分子筛色谱技术中。此外，在食品、动物饲料和化妆品生产中作为潜在的 益生源物质受到了相当的关注。 研究发现来源于氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans)中的某种酶能够利 用麦芽糊精和淀粉部分水解物合成右旋糖酐，这种酶被命名为右旋糖酐糊精酶(dextran dextrinase， DDase)。该酶可催化供体非还原性末端上的a _1，4_吡喃葡萄糖基转移到受 体的非还原性末端上，形成a-l，6-糖苷键。其中主要的反应模式为供体上a-l，4-糖苷 键断裂，葡萄糖单元转移至受体上形成a-l，6-糖苷键。氧化葡萄糖杆菌右旋糖酐糊精酶 可以利用淀粉衍生物糊精来合成右旋糖酐，该右旋糖酐因其独特的结构特性(支链多)，还 可以作为膳食纤维、低脂食品、低热量食品填充剂及膨胀剂等益生源物质。 近年来，有关氧化葡萄糖杆菌右旋糖酐以及右旋糖酐糊精酶(DDase)的研究鲜有 报道。此外，到目前为止，国内尚未有关氧化葡萄糖杆菌右旋糖酐糊精酶分离纯化技术方法 的报道。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种。 为实现上述目的，本专利技术提供的从氧化葡萄糖杆菌中分离纯化右旋糖酐糊精酶的 方法，主要步骤如下 1)将发酵液离心收集细胞，并用磷酸缓冲液悬浮，采用超声波法破碎细胞，在o-4t:条件下离心收集上清酶液； 2)上清酶液部分经硫酸鱼精蛋白沉淀和硫酸铵沉淀得到含右旋糖酐糊精酶的粗 酶液； 3)粗酶液经疏水层析纯化得到右旋糖酐糊精酶粗组分； 4)右旋糖酐糊精酶粗组分经凝胶过滤层析纯化得到精制右旋糖酐糊精酶原液。 所述的方法中，硫酸鱼精蛋白沉淀过程中的硫酸鱼精蛋白与总蛋白的质量比为 0. 1 10%。 所述的方法中，硫酸铵沉淀过程中硫酸铵的终浓度按重量体积比为20 80% 。 所述的方法中，步骤3中疏水层析纯化过程的起始缓冲液中硫酸铵的浓度为 0. 5 3M，洗脱过程采用阶段洗脱法。 所述的方法中，是采用Phenyl疏水层析柱分离纯化。 所述的方法中，步骤4中凝胶过滤层析纯化的洗脱流速为0. 3mL/min lmL/min。 所述的方法中，是采用Superdex 200PG凝胶色谱柱层析纯化。 本专利技术同现有技术相比的显著优点是该方法简便、重复性好且蛋白的得率高。具体实施例方式本专利技术的过程基本是i)发酵液离心收集细胞，用磷酸缓冲液重悬，采用超声波法破碎细胞，o-4t:下离心收集上清酶液。 2)向上清酶液部分添加硫酸鱼精蛋白，该硫酸鱼精蛋白与总蛋白的质量比为 0. 1 10%，离心除去破碎细胞所产生的核酸类物质，同时降低溶液的粘度；再向上清酶液 中加入硫酸铵，该硫酸铵的终浓度为20 80% (w/v)，离心沉淀杂蛋白并获得含右旋糖酐 糊精酶的粗酶液。 3)粗酶液上样于Phenyl疏水层析柱，起始缓冲液中含0. 5 3M的硫酸铵，洗脱阶 段采用阶段洗脱法，纯化得到右旋糖酐糊精酶粗组分。 4)右旋糖酐糊精酶粗组分上样于Superdex 200PG凝胶色谱层析柱，设定洗脱流 速为0. 3mL/min-lmL/min，纯化得到精制右旋糖酐糊精酶。 其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。 以下通过一具体实施例作进一步的说明。 实施例1 步骤1)胞内粗酶液的获得 取100mL的培养液，4t:冷冻离心收集细胞，再重悬于50mM的磷酸缓冲液(pH 6. 47)。采用超声波法破碎细胞，并在fC条件下10000r/min离心20min，收集上清酶液，结 果见表l。 步骤2)硫酸鱼精蛋白沉淀 向步骤1中的胞内粗酶液中加入一定量的硫酸鱼精蛋白，使其添加量达到总蛋白 量的1%，低温缓慢搅拌1小时(h)，高速冷冻离心去除核酸类物质，结果见表1。 步骤3)硫酸铵沉淀 向步骤2中的粗酶液中添加40% (质量体积比)的硫酸铵，低温缓慢搅拌1小时 (h)，高速冷冻离心去除杂蛋白，上清即为含右旋糖酐糊精酶的粗酶液，结果见表l。 步骤4)疏水层析分离纯化工艺 取5mL步骤3中的粗酶液上样于Phenyl疏水层析柱，用AKTA快速蛋白纯化工作站(公知技术)进行纯化。起始缓冲液为50mM磷酸缓冲液(pH 6. 47，内含2M的硫酸铵)，采用硫酸铵2M 0的直线梯度洗脱样品，根据280nm的吸光值接收所需组分。将各活性组分合并并浓縮得到右旋糖酐糊精酶粗组分，结果见表1。 步骤5)凝胶层析纯化工艺 取2mL步骤4中的粗组分上样于Superdex 200PG凝胶色谱柱，用AKTA快速蛋白纯化工作站进行纯化。洗脱缓冲液为50mM磷酸缓冲液(pH 6. 47，内含0. 1M的NaCl)，流速设定为0. 5mL/min，根据280nm的吸光值接收所需组分，结果见表1。 表1 :氧化葡萄糖杆菌右旋糖酐糊精酶的纯化纯化步骤酶活(u)总蛋白(mg)比活(U/mg)纯化倍数收率(％)粗酶液7.9996.750.0831100硫酸鱼精蛋白7.8146.440.1682.0496.79沉淀硫酸铵沉淀7.1934.580.2082.5289.99Phenyl疏水层析4.0510.340.3924.7450.70凝胶层析2.541.212.10025.3031.8本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从氧化葡萄糖杆菌中分离纯化右旋糖酐糊精酶的方法，主要步骤如下：　　１）将发酵液离心收集细胞，并用磷酸缓冲液悬浮，采用超声波法破碎细胞，在０－４℃条件下离心收集上清酶液；　　２）上清酶液部分经硫酸鱼精蛋白沉淀和硫酸铵沉淀得到含右旋糖酐糊精酶的粗酶液；　　３）粗酶液经疏水层析纯化得到右旋糖酐糊精酶粗组分；　　４）右旋糖酐糊精酶粗组分经凝胶过滤层析纯化得到精制右旋糖酐糊精酶原液。

【技术特征摘要】
一种从氧化葡萄糖杆菌中分离纯化右旋糖酐糊精酶的方法，主要步骤如下1)将发酵液离心收集细胞，并用磷酸缓冲液悬浮，采用超声波法破碎细胞，在0-4℃条件下离心收集上清酶液；2)上清酶液部分经硫酸鱼精蛋白沉淀和硫酸铵沉淀得到含右旋糖酐糊精酶的粗酶液；3)粗酶液经疏水层析纯化得到右旋糖酐糊精酶粗组分；4)右旋糖酐糊精酶粗组分经凝胶过滤层析纯化得到精制右旋糖酐糊精酶原液。2. 如权利要求1所述的方法，其中，硫酸鱼精蛋白沉淀过程中的硫酸鱼精蛋白与总蛋 白的质量比为O. 1 10%。3. 如权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛相朝，魏东芝，王舒，邢艳珑，王华磊，
申请(专利权)人：青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]