用核糖醇发酵液生物转化制备L-核糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种用核糖醇发酵液生物转化制备Ｌ－核糖的方法，包括下述步骤：（１）核糖醇发酵液的制备；（２）弗氏葡萄糖杆菌细胞催化反应酶液的制备：将菌种弗氏葡萄糖杆菌（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　　ｆｒａｔｅｕｒｒｉ　　ＡＴＣＣ４９２０７）从斜面转接到种子液中培养１８～４８ｈ；（３）将步骤（２）制备的弗氏葡萄糖杆菌种子液接入所述步骤（１）制备的溶液中进行生物转化；（４）经离心分离除菌、活性炭脱色、减压蒸馏浓缩、色谱分离树脂柱层析、层析液浓缩和有机溶媒结晶后得到高纯度的Ｌ－核糖。本发明专利技术其原料利用率高、收率高、生产成本较低、无需用有机溶剂处理弗氏葡萄糖杆菌细胞，经济环保，产品质量稳定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物化工
，特别涉及采用微生物细胞催化核糖醇发酵液进行生物 转化制备L-核糖的方法。
技术介绍
L-核糖是D-核糖的手性对映异构体，在自然界和生物体内并不存在，是一种价格极 其昂贵的非天然糖。研究表明，L-核糖本身具有一些特殊的功效，它可以增加肿瘤细胞的 死亡率、减少肿瘤细胞的扩散和延缓恶性肿瘤的生长，特别地，L-核糖不但本身对于HIV 病毒具有较好的抑制作用，而且广泛用于合成具有抗病毒活性的核苷类化合物，如临床前 研究表明稀有L-核糖的改性核苷衍生物l-(2-氟-5-甲基-e-L-阿拉伯-呋喃糖)尿嘧啶 (L-FMAU)能有效地抗肝炎B (HBV)病毒、e -L-5-氟_2， ， 3，-双脱氧胞苷(P -L_5FddC)作为抗 病毒剂具有很好的活性，且对人体细胞的毒性比相应的D-核糖衍生物大大降低。另外，L-核糖的衍生物2-脱氧-L-核糖与腺嘌呤等有机碱形成的核苷衍生物在癌症、乙肝等疾病的 治疗方面也具有很大的应用潜能。L-核糖的化学合成研究报道较多，在合成步骤与收率等方面均有了较大提高，但反应 条件和所用试剂仍然要求较高，合成过程涉及大量有机溶剂的使用对环境也有不利的影响， 因而难以适应绿色工业化生产的要求。微生物酶法具有高度的立体选择性、且具备反应条 件温和、对环境友好等优点，以廉价的糖为原料通过微生物或者它们的酶进行生物转化生 产稀有糖类已经成为国内外的研究热点。目前，国内尚未有采用微生物酶法制备L-核糖的报道，利用微生物'生物转化法合成L-核糖在国外已经引起广大研究者的兴趣，近十年来陆续出现相关的研究报道。1996年，日 本学者Shimonishi等从嗜精不动杆菌DL-28 (J"'"eto&"w平DL-28)发酵液中分离纯化得 到了L-核糖异构酶，此后Ahmed等通过实验进一步分析了该酶的反应特征，它分别在35 'C和40 。C下表现出最高的稳定性和活性，可以催化D-甘露糖、D-来苏糖、和L-核糖的异 构化反应，酶催化反应为可逆平衡反应，其中对L-核糖的异构化具有最高的选择性。1999 年，Ahmed等进一步利用纹膜醋酸杆菌04ceto6fl"er flcW/ IF03281)的静息细胞将核糖醇进 行微生物氧化反应，氧化产物L-核酮糖再以嗜精不动杆菌DL-28的L-核糖异构化酶进行微 生物异构化制备L-核糖，其中的氧化转化率达98%，而异构化转化率为70%。此外，更经 济的策略是直接将葡萄糖通过微生物发酵生成核糖醇，再经微生物氧化、微生物异构化和 分离提纯的过程合成L-核糖。如2002年Kawaguchi等的专利(USA 6348326)报道了 L-核糖的微生物合成及分离提纯，将原料葡萄糖在微生物作用下发酵制备得到核糖醇，含核糖醇的发酵液进一步通过甲苯处理过的弗氏葡萄糖杆菌(G/wc朋o^c^ /ra&"m')静息细胞 催化作用氧化成为L-核酮糖，L-核酮糖溶液再通过甲苯处理的凝胶纤维单胞菌 (CW/w/omo"asge/Wa)的静息细胞催化异构化为L-核糖。粗产品溶液经蒸发浓縮，利用阳离 子交换树脂UBK530，以四柱串联的树脂柱处理，再经脱盐、脱色与结晶，得到L-核糖， 产品纯度达99%，分离回收率为55.1%，此工艺以葡萄糖为原料制备高价值L-核糖，具有 较好的工业化前景，但制备过程涉及有机溶剂甲苯等的使用对环保有一定的影响，且分离 收率不高。2007年，国际专利(W0 2007/021879 A2)公开了基因工程菌细胞催化核糖醇制备L-核糖的新技术，将洋芹菜中提取的甘露醇脱氢酶基因在大肠杆菌BL21中表达。当核糖醇浓 度为2%时，用构建的工程菌细胞催化反应48h，可将约25%的核糖醇转化成卜核糖。2008 年，Woodyer等的文献进一步报道重组甘露醇脱氢酶基因的大肠杆菌BL21细胞催化制备L-核糖的研究结果反应体系中添加5-500uMZnCl2和5g/L的甘油均可提高L-核糖的生产； 在优化的条件下，放大至l升发酵反应时，底物核糖醇(浓度100g/L)在反应72h后55% 转化成L-核糖。通过基因工程菌将核糖醇生物转化制备L-核糖的转化率有待于进一步提高， 同时生物转化所需时间也较长；此外，由于核糖醇本身原料价格相对较高，与以廉价的葡 萄糖为原料相比，以核糖醇为原料制备L-核糖显然不经济。事实上，Kawaguchi等以葡萄糖为原料通过三步生物法制备L-核糖时，L-核酮糖异构 化为L-核糖属于可逆反应，其异构化转化率仅为70%。此外，其产品的分离收率也较低。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术中的不足，提供一种用核糖醇发酵液生物转化制备L-核 糖的方法。本专利技术的技术方案概述如下用核糖醇发酵液生物转化制备L-核糖的方法，包括下述步骤(1) 核糖醇发酵液的制备以葡萄糖为原料，通过菌种发酵生产核糖醇，除去菌体，稀释至核糖醇含量为5 50 g/L， 121 'C下灭菌15 min;(2) 弗氏葡萄糖杆菌细胞催化反应酶液的制备将菌种弗氏葡萄糖杆菌(G/"c卵oto"w ^"Otewm'ATCC49207)从斜面转接到种子液中培养18 48 h;(3) 将步骤(2)制备的弗氏葡萄糖杆菌种子液按1% 20%的体积比接入所述步骤(1)制 备的溶液中，调节pH值为4.0 7. 0、在转速为100 500 rpm、通气流量为0.1 1.5 vvm 的条件下进行生物转化18 48 h;(4) 将生物转化后的溶液经离心分离除菌、活性炭脱色、减压蒸馏浓縮、色谱分离树脂柱 层析、层析液浓縮和有机溶媒结晶后得到高纯度的L-核糖。优选的是所述步骤(1)为以葡萄糖为原料，选高渗酵母球头三型孢菌 (7yic力o印oro/7W'oksoe^c印/ a7^sATCC 16958)为出发菌株，经斜面培养、种子培养后， 在温度25 45°C， pH为4 7的条件下发酵80 160 h，葡萄糖完全消耗后，通过离心除 去菌体，稀释至核糖醇含量为5 50 g/L， 121 °〇下灭菌15 min。所述步骤(2)为将所述菌种弗氏葡萄糖杆菌从斜面转接到种子液中培养18 48 h， 所述种子培养基组成为甘油10 25 g/L、玉米浆粉10 25 g/L、葡萄糖10 30 g/L、 NaCl 1 15 g/L、核糖醇O. 5 5 g/L、 ZnCl2 1 10 umol/L和FeCl3 1 1Oumol/L，种子罐 的培养温度为25 35 。C，通气量为0.5 1.5 vvm，转速为100 500 rpm。所述步骤(4)中所述色谱分离树脂为Ca型强酸性阳离子交换树脂。所述Ca型强酸性阳离子交换树脂可以选英国产PUROLITE PCR642钙型离子交换树脂， 或国产001X7型强酸性阳离子交换树脂经0.5 mol/L的CaCl2水溶液转成Ca型，或D001型强 酸性阳离子交换树脂经O. 5 mol/L的CaCl2水溶液转成Ca型。本专利技术的方法以廉价的葡萄糖为原料制备高价的L-核糖，其原料利用率高、收率高、生产成本较低、无需用有机溶剂(如甲苯)处理弗氏葡萄糖杆菌细胞，无有机溶剂造成的 环境污染，产品质量稳定，本专利技术还提出了用Ca型阳离子交换树脂进行分离纯化L-核糖 醇的工艺，分离纯化工艺简单本文档来自技高网...

【技术保护点】
用核糖醇发酵液生物转化制备Ｌ－核糖的方法，其特征是包括下述步骤：　　　　（１）核糖醇发酵液的制备：以葡萄糖为原料，通过菌种发酵生产核糖醇，除去菌体，稀释至核糖醇含量为５～５０ｇ／Ｌ，灭菌；　　　　（２）弗氏葡萄糖杆菌细胞催化反应酶液的制备：将菌种弗氏葡萄糖杆菌（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　　ｆｒａｔｅｕｒｒｉ　　ＡＴＣＣ　　４９２０７）从斜面转接到种子液中培养１８～４８ｈ；　　　　（３）将步骤（２）制备的弗氏葡萄糖杆菌种子液按１％～２０％的体积比接入所述步骤（１）制备的溶液中，调节ｐＨ值为４．０～７．０、在转速为１００～５００ｒｐｍ、通气流量为０．１～１．５ｖｖｍ的条件下进行生物转化１８～４８ｈ；　　　　（４）将生物转化后的溶液经离心分离除菌、活性炭脱色、减压蒸馏浓缩、色谱分离树脂柱层析、层析液浓缩和有机溶媒结晶后得到高纯度的Ｌ－核糖。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李良智，万屹东，芮新生，元英进，王伟，尤吉，
申请(专利权)人：常茂生物化学工程股份有限公司，天津大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]