一种检测微小核糖核酸与胃癌组织的相关程度的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种微小核糖核酸与胃癌组织的相关程度的检测方法。检测过程分为标本的准备，组织总RNA的提取，逆转录合成cDNA第一链，荧光定量聚合酶链反应（qPCR），用统计学方法进行数据分析等5个步骤，通过本方法能较为准确的测定所检测的微小核糖核酸与胃癌组织的相关程度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医药检测方法
，尤其涉及一种检测微小核糖核酸与胃癌组织 相关程度的检测方法。
技术介绍
胃癌是一种世界范围内的普通癌症，但在东亚地区属于高发癌症。常年以来，医疗 工作者在胃癌的发病机理和新的诊断标志物和治疗目标方面做了大量研究，然而在胃癌的 发病机理方面仍没有突破进展。近年来，在传统的癌症基金和肿瘤抑制基因的研究已经拓 展到一个新的种类-微小核糖核酸(microRNAs)，微小核糖核酸（以下称miR)的发现提 供的一种研究治疗癌症的新的契机。miR作为新发现的基因表达调控因子，是一类分布广泛 的小的非编码蛋白质的RNA，可抑制靶基因转录或蛋白翻译从而沉默靶基因的表达。近年来 众多研究表明miR在肿瘤转移的过程中起到了关键作用，其主要以干预mRNA翻译的方式负 向调控基因的表达，参与肿瘤转移的发生发展。研究表明，某些miR在不同肿瘤表达具有特 异性，可作为某些肿瘤诊断的标志物，从而提高肿瘤的诊断和治疗，为人类肿瘤治疗提供了 新的方向和手段。 有研究表明，miR-433在多种肿瘤组织中低表达，其特异性的表达水平降低与肿瘤 的发生、发展具有相关性。有研究发现miR-433可以通过抑制cAMP应答元件CREBl进而抑 制肝癌细胞的生长和迁移，并且发现miR-433可能与miR-127 -起参与了肝癌的发生和发 展。miR-433在肝癌组织低表达，并且还抑制了肝癌细胞的生长与分化。miR-433对胃癌细 胞系HGC-27的生长，细胞周期，细胞迁移及细胞侵袭具有显著的抑制作用，其可能是通过 KRAS和MAPK4信号通路对细胞生物学行为进行调节的。
技术实现思路
为了研究微小核糖核酸与胃癌组织的相关程度，本专利技术提出了一种新的检测微小 核糖核酸与癌症组织相关程度的检测方法。 本专利技术提出的一种检测微小核糖核酸与癌症组织相关程度的检测方法，其检测过 程为： 1、标本的准备：选取手术切除的胃癌标本80例，每例标本均留取肿瘤组织和距肿 瘤边缘5cm以上的配对癌旁组织；手术标本离体后，于20-35min内液氮速冻，保存于-80°C 冰箱备用；根据2010年国际抗癌联盟制定的TNM分期标准进行临床分期I，II，III和IV期 各20例；所有病例均确诊为胃癌，临床资料完整，均未接受放化疗。 2、组织总RNA的提取：采用Trizol裂解细胞，具体步骤参照说明书操作，分别提取 胃癌组织及配对癌旁组织总RNA;分光光度计测定RNA浓度，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完 整性。 3、逆转录合成cDNA第一链：逆转录过程按照所购逆转录试剂盒的操作说明书进 行。 4、荧光定量聚合酶链反应（qPCR):荧光定量聚合酶链反应（qPCR)体系使用了miR 和内参U6 引物以及PCR试剂盒；PCR程序为 95°C10min，95°C10s，60°C20s，72°C42s共 40 个循环，并进行溶解曲线检测；所有样品均做3个重复，阴性对照以水代替cDNA模板。 5、用统计学方法进行数据分析：数据均以均数土标准差纟I±s>表示，应用 SPSS18. 0统计软件分析，计量资料采用独立样本t检验或配对设计t检验。 优选的：所述RNA抽提试剂Trizol购自美国Invitrogen公司，cDNA逆转录试剂 盒（All-in-One?miRNAFirst-StrandcDNASynthesisKit)和SYBRGreenIqPCR试剂 盒（All-in-〇ne?miRNAqPCRKit)均购自广州复能基因有限公司。qPCR仪为美国ABI7500 系统。优选的：所述荧光定量聚合酶链反应（qPCR)体系中的miR为miR-433。优选的：所述荧光定量聚合酶链反应（qPCR)体系中的miR-433和内参U6引物以 及PCR试剂盒（All-in-One?miRNAqPCRKit)均购自广州复能基因有限公司。【附图说明】 下面结合附图对本专利技术做进一步的说明： 图1为溶解曲线分析miR-433扩增效率和内参U6扩增效率。 下面，通过具体实施例对本专利技术的技术方案进行详细说明。【具体实施方式】 本专利技术提出的一种检测微小核糖核酸与癌症组织相关程度的检测方法，其检测过 程为： 1、标本的准备：选取手术切除的胃癌标本80例，其中男60例，女20例，每例标本 均留取肿瘤组织和距肿瘤边缘5cm以上的配对癌旁组织；手术标本离体后，于30min内液氮 速冻，保存于_80°C冰箱备用；根据2010年国际抗癌联盟制定的IT#分期标准进行临床分 期I，II，III和IV期各20例；所有病例均确诊为胃癌，临床资料完整，均未接受放化疗。 2、组织总RNA的提取：采用Trizol裂解细胞，具体步骤参照说明书操作，分别提取 胃癌组织及配对癌旁组织总RNA;分光光度计测定RNA浓度，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完 整性；所述RNA抽提试剂Trizol购自美国Invitrogen公司。 3、逆转录合成cDNA第一链：逆转录过程按照所购逆转录试剂盒的操作说明书进 行。cDNA逆转录试剂盒（All-in-One?miRNAFirst-StrandcDNASynthesisKit)购自广 州复能基因有限公司。 4、荧光定量聚合酶链反应（qPCR):荧光定量聚合酶链反应（qPCR)体系使用 了miR-433和内参U6引物以及PCR试剂盒。具体实验试剂及结果见表1。PCR程序为 95°C10min，95°C10s，60°C20s，72°C42s共40个循环，并进行溶解曲线检测。所有样品均 做3个重复，阴性对照以水代替cDNA模板。所述荧光定量聚合酶链反应（qPCR)体系中的 miR-433和内参U6引物以及PCR试剂盒（All-in-One?miRNAqPCRKit)均购自广州复能 基因有限公司。 表1荧光定量聚合酶链反应（qPCR)体系 5、用统计学方法进行数据分析：数据均以均数土标准差（；±s)表示，应用 SPSS18. 0统计软件分析，计量资料采用独立样本t检验或配对设计t检验。 统计学分析结果：a.总RNA提取鉴定：总RNAA2M/A2S。均为1. 8~2. 0,琼脂糖凝胶电泳显示28s、18s， 5s条带清晰，28s/18s亮度比约I. 8,说明RNA纯度较高且完整性良好。b.PCR溶解曲线：miR-433扩增效率和内参U6扩增效率接近。溶解曲线分析均成 单一峰，说明引物特异性良好（图1)。c.miR在胃癌和配对癌旁组织中的表达：采用AACt法对定量结果进行分析，AACt = (CTmiR433 癌-CTU6 癌）-(CTmiR433 癌芳-CTU6 癌芳），AACt 值为负，miR的表达 上调，AACt值为正，miR的表达下调。 d.胃癌组织miR的表达与胃癌临床病例特征的关系：在80例样本中，男为60例， 女为20例，其AACt值分别为2. 57±1. 40和2. 51±1. 30 ;32例< 60岁患者和48例兰60 岁，患者的AACt值分别为2. 56±1. 37和2. 56±1. 38 ;在35例肿瘤直径< 5cm和45例肿 瘤直径兰5cm的患者中，AACt值分别为2. 06±1.49和2. 92±1. 17 ;24例低分化患者与 56例中-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测微小核糖核酸与胃癌组织相关程度的检测方法，其特征在于，检测过程为：a、标本的准备：选取手术切除的胃癌标本80例，每例标本均留取肿瘤组织和距肿瘤边缘5cm以上的配对癌旁组织；手术标本离体后，于20‑35min内液氮速冻，保存于‑80℃冰箱备用；根据2010年国际抗癌联盟制定的TNM分期标准进行临床分期I，II，III和IV期各20例；所有病例均确诊为胃癌，临床资料完整，均未接受放化疗； b、组织总RNA的提取：采用Trizol裂解细胞，具体步骤参照说明书操作，分别提取胃癌组织及配对癌旁组织总RNA；分光光度计测定RNA浓度，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性；c、逆转录合成cDNA第一链：逆转录过程按照所购逆转录试剂盒的操作说明书进行；d、荧光定量聚合酶链反应（qPCR）：荧光定量聚合酶链反应（qPCR）体系使用了miR和内参U6引物以及PCR试剂盒；PCR程序为95℃10 min，95℃10s，60℃20s，72℃42s共40个循环，并进行溶解曲线检测；所有样品均做3个重复，阴性对照以水代替cDNA模板；e、用统计学方法进行数据分析：数据均以均数标准差（s）表示，应用SPSS18.0统计软件分析，计量资料采用独立样本t检验或配对设计t检验。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：顾掌生，吴魏，戴利成，
申请(专利权)人：湖州市中心医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33