中低温油藏采油功能菌快速检测基因芯片及其用途。本发明专利技术涉及一种快速检测中低温油藏采油功能菌的基因芯片及其用途。所述芯片包括针对细菌的16条16S rDNA探针、42条ITS探针和针对功能基因的13条探针，探针可以特异性检测6种中低温油藏采油功能菌属、15种采油功能菌种和2个功能基因；所述芯片可以快速检测采油过程及环境样品中烃氧化功能菌及其烃氧化、硫酸盐还原功能基因的分布及变化规律；适用样品为预测含有目的DNA序列的石油开发水体材料。本发明专利技术将为检测油藏采油功能菌提供一种快速、简易的工具；同时为检测现场实验的效果提供技术支持。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种快速检测中低温油藏采油功能菌基因芯片及其用途，属于基因芯 片领域和资源环境微生物
技术介绍
随着微生物采油技术在石油天然气勘探开发和环境修复等领域的广泛应用，相关 微生物的检测鉴定及群落分析也成为重要的研究内容。目前油田微生物检测的常用分子生 态方法有构建克隆文库、变性梯度凝胶电泳（DGGE)、实时定量PCR技术等方法。 (1)实时定量聚合酶链反应实时焚光定量PCR (real-time fluorescent quantitative polymerasechain reaction)，是在常规PCR反应过程中加入荧光染料或者荧光探针，利用PCR过程中荧光的 变化指示模板中特定DNA序列的数量。实时荧光定量PCR的重复性好，灵敏度和特异性也 比较高，整个过程耗时短，从提取模板到结果分析，只需要8个小时左右，缺点是检测DNA 种类比较单一。 (2)克隆文库分析 克隆文库是通过PCR扩增基因序列，通过基因与载体连接和感受态细胞转化，制 作基因单克隆文库，然后对文库中基因序列进行多样性分析的方法。该方法成本较低，能够 在一定程度上反应出群落的多态性，但是检测耗时，操作繁琐。 上述分子生态学方法应用于油藏大量检测工作时往往操作复杂，费时费力，不利 于对油藏现场样品进行及时快速的检测。相比之下，基因芯片技术具有高通量、快速检测、 灵活度高等特点，借助基因芯片技术，建立油田微生物检测新方法，有助于研究微生物变化 规律与油藏微生物激活之间的关系，揭示采油功能菌定向激活机理，为内源激活技术的应 用提供系统的理论基础。油藏内源微生物按功能划分，主要包括烃氧化菌、好氧腐生菌、厌氧发酵菌、硝 酸盐还原菌、硫酸盐还原菌和产甲烷菌等。其中烃氧化菌是油藏环境中普遍存在的一类 菌，也是微生物提高石油采油率技术中非常重要的功能菌，无论在外源微生物采油还是 内源微生物采油中都发挥着关键作用。相反，硫酸盐还原菌能够腐蚀管道，影响生产安 全是微生物采油中需要严格抑制的有害菌。根据报道，两类微生物发挥作用的关键基因 为经氧化菌解经关键基因alkB(alkanehydroxylaseB)和硫酸盐还原菌关键功能基因 dsrB(dissimilatorysulfitereductaseB)。胜利油田目前已针对油藏水体基因组16S rDNA序列开发出针对中高温油藏的细菌种群检测基因芯片，该芯片包含样品测序检测到的 109个细菌属的429条16SrDNA探针，覆盖范围广，但是针对中高温油藏，且对功能微生物 的针对性不强。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种中低温油藏采油功能菌快速检测基因芯片及其使用方法， 弥补上述微生物生态技术以及现有油藏微生物检测芯片存在的操作费时，不够简便，针对 性不强的缺点，同时芯片涉及中低温油藏功能微生物检测探针，填补此领域的空白，另外芯 片上的功能基因探针使得芯片不仅能够用于快速检测采油过程及环境样品中烃氧化功能 菌，还能够反映烃氧化、硫酸盐还原功能基因的分布及变化规律。应用该芯片能够指示油藏 中是否存在常见的功能微生物，初步了解目标油藏的主要微生物结构，更重要的是能够进 一步对油井使用微生物采油技术的效果进行评价，为微生物技术研究水平和现场实施效果 提尚提供方法基础。 本专利技术的技术方案如下： 中低温油藏采油功能菌快速检测基因芯片，该基因芯片在固相载体上固定有三类 探针：针对6种中低温油藏采油功能细菌属的16SrDNA探针；针对15种中低温油藏采油功 能细菌种的ITS探针；针对2种功能基因的探针；以上探针的序列如下表1_表2 : 表I16SrDNA探针和功能基因alkB及dsrB探针 第1步、设计功能菌及功能基因特异性探针检测属的 16SrDNA序列来源于从RDPRelase11 数据库（http://rdp.cme.msu. edu/hierarchy/hb_intro.jsp);检测种的ITS序列来源于NCBIGenome数据库（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/ ?term=)，同时使用ITS通用引物对检测种及其近缘 种ITS基因进行扩增测序，测序结果作为补充序列；功能基因alkB和dsrB序列来源于 Fungene数据库（http://fungene.cme.msu.edu/)。依据收集序列，设计针对目的基因的属 特异性探针组，种特异探针和功能基因特异探针，探针序列如SEQIDNO. 1-71所示。针对 16SrDNA的探针以逻辑"与"的方式设计成探针组，组内探针作为一个整体提高检测的特异 性。 第2步、合成特异性探针 探针的结构通式：NH2-POly(T)-探针条码序列，见12表示探针5'端经过氨基修饰， poly(T)-探针条码序列长度为40nt;按照探针的结构通式合成探针； 第3步、制备基因芯片： 使用BioDotAD5000芯片点样仪将探针以设定的矩阵固定到醛基化修饰的玻片 上，紫外交联12小时，制备好的芯片避光保存；其中，每张芯片上包含8个相同的芯片矩阵。 芯片矩阵由针对6个细菌属、15个细菌种和2个功能基因的共71条探针，阴性质控探针NC 和阳性质控探针PC组成的阵列和荧光定位探针FP组成，每个探针设置三个重复。NC是一段氨基修饰的寡核昔酸探针，与杂交液中的所有待检测序列不会杂交，可 以指示芯片质量的可靠性，避免假阳性；PC是一段氨基修饰的寡核昔酸探针，可以与荧光 标记的目的片段上的保守序列杂交，用于杂交过程的质控，避免假阴性；FP为3'端经过Cy3 修饰的NC探针，能够紫外激发荧光，用来定位探针在矩阵中的位置；NC序列为nh2-ttttttttttttttttttttttttttttttttttttttt;PC序列为nh2-tttttttttttttttttgtacacaccgcccgtcacaccat。 本专利技术同时提供了上述中低温油藏采油功能菌快速检测基因芯片的使用方法，包 括以下步骤： 第1步、目的片段扩增 根据检测目标不同，以样品基因组DNA为模板，选用不同的通用引物扩增不同的 目的片段。 第I. 1步、检测功能菌属时，16SrDNA全长基因分成片段1 (约前800bp)和片段 2(约后700bp)两个部分扩增，分别用通用引物27f/802r和783f/1492r进行PCR扩增；引物 27f序列为 5' -AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3' ；引物 802r序列为 5' -GACTACCAGGGTATCTAATCC-3' ；引物 783f序列为 5' -GGATTAGATACCCTGGTAGTCCA-3' ；引物 1492r序列为 5' -TACGGCTACCTTGITACGACTT-3' ； PCR程序为95 °C预变性5分钟，94°C变性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸1分钟， 变性到延伸循环35次，72°C后延伸10分钟；PCR体系如下表3 ; 表3 16S rDNA目的基因片段1和片段2扩增体系 第I. 2步、检测功能菌种时，ITS片段使用通用引物783f/5794r进行PCR扩增；引物783f序列为5' -GGATTAGATACCCTGGTAGTCCA-3'；引物579本文档来自技高网...
【技术保护点】
中低温油藏采油功能菌快速检测基因芯片，其特征在于该基因芯片在固相载体上固定有三类探针：针对6种中低温油藏采油功能细菌属的16S rDNA探针；针对15种中低温油藏采油功能细菌种的ITS探针；针对2种功能基因的探针；所述的6种中低温油藏采油功能细菌属为不动杆菌属、芽孢杆菌属、伯克霍尔德菌属、迪茨氏菌属、海杆菌属和假单胞菌属；所述的15种中低温油藏采油功能细菌种为乙酸钙不动杆菌、琼氏不动杆菌、鲁氏不动杆菌、蜡样芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、睾丸酮丛毛单胞菌、海迪茨氏菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、门多萨假单胞菌、恶臭假单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌；所述的2种功能基因为烃氧化菌解烃关键基因alkB和硫酸盐还原菌关键功能基因dsrB；所述的不动杆菌属16S rDNA探针序列如SEQ ID NO.1‑3所示；芽孢杆菌属16S rDNA探针序列如SEQ ID NO.4‑6所示；伯克霍尔德菌属16S rDNA探针序列如SEQ ID NO.7‑8所示；迪茨氏菌属16S rDNA探针序列如SEQ ID NO.9‑11所示；海杆菌属16S rDNA探针序列如SEQ ID NO.12‑13所示；假单胞菌属16S rDNA探针序列如SEQ ID NO.14‑16所示；所述的乙酸钙不动杆菌ITS探针序列如SEQ ID NO.17‑18所示；琼氏不动杆菌ITS探针序列如SEQ ID NO.19‑21所示；鲁氏不动杆菌ITS探针序列如SEQ ID NO.22‑23所示；蜡样芽孢杆菌ITS探针序列如SEQ ID NO.24‑26所示；地衣芽孢杆菌ITS探针序列如SEQ ID NO.27‑29所示；短小芽孢杆菌ITS探针序列如SEQ ID NO.30‑32所示；枯草芽孢杆菌ITS探针序列如SEQ ID NO.33‑35所示；洋葱伯克霍尔德菌ITS探针序列如SEQ ID NO.36‑38所示；睾丸酮丛毛单胞菌ITS探针序列如SEQ ID NO.39‑41所示；海迪茨氏菌ITS探针序列如SEQ ID NO.42‑44所示；铜绿假单胞菌ITS探针序列如SEQ ID NO.45‑47所示；荧光假单胞菌ITS探针序列如SEQ ID NO.48‑50所示；门多萨假单胞菌ITS探针序列如SEQ ID NO.51‑53所示；恶臭假单胞菌ITS探针序列如SEQ ID NO.54‑56所示；嗜麦芽寡养单胞菌ITS探针序列如SEQ ID NO.57‑58所示；所述的烃氧化菌解烃关键基因alkB探针序列如SEQ ID NO.59‑63所示；所述的硫酸盐还原菌关键功能基因dsrB探针序列如SEQ ID NO.64‑71所示。...
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：马挺，吴运强，代学成，李国强，聂小斌，王红波，戴柳冰，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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