检测和定量样品中靶核酸序列的试验方法和系统，其在靶标特异性探针序列和捕获探针序列存在的情况下使用扩增方法和实时扩增方法，用于显示样品中靶序列的扩增并从而表明该靶序列是否存在。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】试验方法和系统 相关申请的交叉参考 本申请要求2012年8月16日提交的美国临时专利申请号61/684, 104的优先权 和权益，该专利申请的说明书通过引用全文纳入本文。 关于联邦资助研究的声明 本专利技术是在美国国土安全部第HSHQDC-10-C-00053号基金资助下进行。政府享有 本专利技术的某些权利。 专利技术背景 已开发了多种不同方法用于检测样品混合物中是否存在给定的核酸序列。这些方 法被用于诊断、研究工具、病原体检测的目的和多种其他应用。已证明在鉴定给定靶核酸序 列是否存在方面高度有用（特别是预期这类靶标的拷贝数目较低时）的一种方法是实时聚 合酶链式反应，或实时PCR。 实时PCR常规用于对生物样品中感兴趣核酸的检测。实时PCR的综述参见，例如M Tevfik Dorak(编）（2006) Real-time PCR(Advanced Methods)(《实时 PCR(高级方法）》）， TF 公司（Taylor&Francis)，第一版ISBN-10:041537734X ISBN-13:978-0415377348， 和 Logan 等（编）（2009)Real_Time PCR:Current Technology and Applications(《实 时PCR:新编技术和应用》），凯斯特学术出版社（Caister Academic Press)，第一版 ISBN10:1904455395, ISBN-13:978-1904455394。其他细节还可参见例如 Gelfand 等， "Homogeneous Assay System Using The Nuclease Activity of A Nucleic Acid Polymerase (使用核酸聚合酶的核酸酶活性的均匀分析系统）"USPN 5, 210, 015 ;Leone等， (1995) "Molecular beacon probes combined with amplification by NASBA enable homogenous real-time detection of RNA(分子信标探针与NASBA扩增的结合能均勾实时 检测 RNA)" Nucleic Acids Res. 26:2150-2155;以及 Tyagi 和 Kramer (1996) "Molecular beacons:probes that fluoresce upon hybridization(分子信标：杂交时发焚光的探 针）'Mature Biotechnology 14:303-308。传统上，用于在单一反应容器（如多孔板的孔） 中检测多于一种靶核酸/样品的单孔多重技术（multiplexing)利用对各扩增子具有特异 性的自淬灭PCR探针（诸如TAQMAN?或分子信标探针）来实现。在与溶液中的扩增子结合 后，或在PCR过程中的探针降解后，所述探针不淬灭（unquench)，生成可检测信号。所述探 针用不同波长的荧光团标记，使得能在单个"单罐式"反应中实现多至约5个靶标的多重化 能力。由于实际光谱范围和标记物发射的限制，很难实现超过约5个探针/反应。这严重 限制了单一反应的多重化，进而严重限制了每个样品能被筛选的靶标数量，并提高了检测 多种感兴趣靶标的试剂成本和设备复杂性。 核酸阵列代表另一种多重化检测扩增产物的方法。最常见地，对样品进行扩增反 应，然后在核酸阵列上分别检测扩增子。例如Sorge"Methods for Detection of a Target Nucleic Acid Using A Probe Comprising Secondary Structure (使用包含二级结构探针 检测靶核酸的方法）" USPN 6, 350, 580提出了通过从扩增混合物中纯化探针来捕获扩增后 释放的探针然后检测探针。这种生成和检测扩增子的多步法使对于扩增混合物的实时分析 变得不切实际。 还提出了多种在存在捕获核酸的情况下扩增反应物的方法。例如，Kleiber等 "Integrated Method and System for Amplifying And Detecting Nucleic Acids (扩增 和检测核酸的综合方法与系统）" USPN 6, 270, 965提出了通过渐消式（evanescence)诱 发焚光来检测扩增子。相似地，Alexandre 等"Identification and Quantification of a Plurality of Biological (Micro) Organisms or Their Components (多种（微）生物 体或其成分的鉴定和定量）"USPN 7, 829, 313,提出了在阵列上检测扩增子。在另一个示 例中，通过检测作为扩增结果生成的探针片段来检测靶多核苷酸，所述检测是例如通过结 合至电极，然后进行电化学检测。参见，例如Aivazachvilli等，"Detection of Nucleic Acid Amplification (核酸扩增的检测）"美国公布号 2007/0099211 ;Aivazachvilli 等， "Systems and Methods for Detecting Nucleic Acids (检测核酸的系统和方法）"美 国公布号 2008/0193940,和 Scaboo 等，"Methods And Systems for Detecting Nucleic Acids (检测核酸的方法和系统）"美国公布号2008/0241838。 所有这些方法均存在限制其用于多重靶核酸检测的实践限制。例如Kleiber (USPN 6, 270, 965)依靠渐消式诱发荧光以检测阵列表面处的扩增子的荧光，并且需要复杂和昂 贵的光学元件和阵列。Alexandre (USPN7, 829, 313)提出在阵列上检测扩增子；如Kleiber 所述，这显著增加了阵列成本，因为必须个体化设计各阵列以检测各扩增子。实践中，对于 阵列上的不同扩增子可能难以实现相似的杂交动力学，特别是当扩增子相对较大时，正如 Alexandre中所述。另外，对于如何在其中有同样包含高水平信号背景的伴随溶液相的阵列 上或者在原位热循环中保持稳定的阵列上检测信号，本领域几乎没有提供指导。 本专利技术克服了本领域中这些问题和其他问题。通过通读以下内容可以更完整地理 解本专利技术。 专利技术概述 本专利技术提供了新颖的阵列方法和系统，以及这类方法和系统中使用的装置、试剂 和反应混合物。在至少一个方面，本专利技术提供了一种检测样品中是否存在至少一种第一靶 核酸序列（并可选地定量其增量）的方法。该方法包括对样品进行扩增反应，所述扩增反 应能够在至少一种第一核酸探针组存在的情况下扩增靶核酸序列。该第一探针组包含含有 与其连接的荧光团的捕获探针、与捕获探针的至少一部分和靶核酸序列的至少一部分互补 的靶标特异性核酸探针，且该靶标特异性探针包含与其连接的淬灭剂，从而使淬灭剂在该 靶标特异性探针与捕获探针杂交时淬灭来自荧光团的荧光。该方法还包括在一个或多个聚 合酶链本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测样品中是否存在至少一种第一靶核酸序列的方法，所述方法包括：对所述样品进行扩增反应，所述扩增反应能够在至少一种第一核酸探针组存在的情况下扩增所述靶核酸序列，所述第一核酸探针组包含：捕获探针，其包含与其连接的荧光团；靶标特异性核酸探针，其与所述靶核酸序列和所述捕获探针的至少一部分互补，且包含与其连接的淬灭剂，从而在所述靶标特异性核酸探针与所述捕获探针杂交时，所述淬灭剂淬灭来自所述荧光团的荧光；以及在一个或多个聚合酶链式反应循环后检测来自所述样品的荧光，荧光的增加表示存在所述靶核酸序列。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：B·塔弗特，K·斯卡布，J·拉，C·哈迪，
申请(专利权)人：NVS技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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