本发明专利技术公开了一种基于基因芯片分析研究大肠杆菌丁醇耐受性关键基因的方法，属于生物工程技术领域。具体涉及采用基因芯片技术分析在丁醇胁迫条件下大肠杆菌E.coli JM109/pHACMB8和对照菌株的基因组转录水平差异，鉴定获得与大肠杆菌丁醇耐受性密切相关的两个基因yibT和yghW，以及与丁醇耐受性相关的主要代谢途径，为进一步阐明微生物菌株的丁醇耐受性机制提供了理论依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，涉及一种基于基因芯片分析研究大肠杆菌丁醇耐受性关键基因和相关代谢途径的方法，应用于大肠杆菌丁醇耐受性机制的探究。
技术介绍
大多数有机溶剂对微生物细胞生长有抑制作用。它们能够破坏细胞膜，改变胞内pH，引发胞内离子、代谢物质的丢失和蛋白的错误折叠，导致细胞受损甚至死亡，这严重影响了微生物菌株在工业领域中的应用。因此，深入研究微生物细胞的有机溶剂耐受机制，对于微生物菌株有机溶剂耐受性，及其在工业领域的应用具有重要的意义。基因芯片是近年来迅速发展的一门高新生物技术，具有高效、快速、准确、灵敏等优点，可以同时对生物体成千上万条基因的功能进行研究，特别基因表达与调控的复杂网络关系。2003年，Hiroyuki等人采用基因芯片技术发现marA基因的过表达能够显著提高大肠杆菌的有机溶剂耐受性，其原因可能是marA编码的MarA蛋白是acrAB-tolC外排泵的转录因子，它的过表达有助于将细胞内有机溶剂排出体外(Hayashi S,et al.Journal of Bioscience and Bioengineering.2003,95(4):379-383)。2007年，Hirasawa等采用该技术检测了两株酿酒酵母在5％(v/v)乙醇胁迫下的基因表达谱，通过对基因表达数据聚类分析，发现色氨酸生物合成相关基因的表达有助于提高酵母细胞的乙醇耐受性(Hirasawa T,et al.Journal of Biotechnology,2007,131(1):34-44.)。然而，关于微生物菌株的丁醇耐受性机制仍有待进一步研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是基于基因芯片分析研究大肠杆菌丁醇耐受性相关的关键基因及代谢途径，通过对细胞膜脂肪酸组分分析，探索关键基因的作用机制。与大肠杆菌丁醇耐受性相关的主要代谢途径包括，乙醛酸二羧酸，丙酸，丙酮酸，氧化磷酸化，糖和氨基酸代谢途径，以及ABC转运系统。基因yibT、yghW的敲除有助于提高大肠杆菌的丁醇耐受性，其耐受机制与细胞膜不饱和脂肪酸含量的增加有关。本专利技术为构建有机溶剂耐受菌株提供实验依据，为进一步阐释微生物的丁醇耐受性机制提供理论基础。本专利技术的技术方案：将在前期研究中获得的丁醇耐受菌株E.coli JM109/pHACMB8和对照菌株在0.8％(v/v)丁醇浓度下培养1.5h后，分别提取实验菌株和对照菌株的RNA，每个样品分别包含三个生物学重复。采用基因芯片(Agilent定制芯片design ID：020097)技术分别对突变株和对照菌株的基因转录水平进行检测，经数据归一化处理最终得出丁醇耐受突变株与对照菌株相比基因的差异表达情况。根据基因芯片差异基因的筛选参数，筛选差异倍数>2，p-value<0.05的差异表达基因。结果共获得329个差异表达基因(其中197个基 因转录水平上调，132个基因转录水平下调)。基因芯片相关数据已被提交到GEO公共数据库中，编号为GSE79305。利用KEGG数据库对差异基因的分布特点及基因的功能进行分析。运用基因工程的方法(基因过表达和基因敲除)对15个上调基因和14个下调基因的功能进行研究。通过测定细胞膜脂肪酸含量对丁醇耐受性关键基因yibT、yghW的耐受机制进行研究。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术采用基因芯片技术对丁醇耐受菌株E.coli JM109/pHACMB8和对照菌株的转录组进行分析，获得了329个差异表达基因(差异倍数均在2倍以上，p-value<0.05)，其中197个基因转录水平上调，132个基因转录水平下调。(2)运用KEGG数据库对差异表达基因进行了功能和代谢路径富集分析。发现与丁醇耐受性相关的代谢通路有乙醛酸二羧酸代谢，丙酸代谢，丙酮酸代谢，氧化磷酸化，糖代谢，氨基酸代谢以及ABC转运系统。(3)运用基因工程的方法对15个上调基因和14个下调基因的功能进行了验证。结果表明：上调基因glcF、gcl、yhaR、ybbQ和tdcE的过表达有助于提高大肠杆菌的丁醇耐受性；而将下调基因yibT和yghW敲除后，菌株的丁醇耐受性也有所提高。对yibT、yghW的耐受机制进行研究发现敲除菌株ΔyibT和ΔyghW的细胞膜不饱和脂肪酸含量显著增加。本专利技术为构建有机溶剂耐受菌株提供实验依据，为进一步阐释微生物的丁醇耐受性机制提供理论基础。附图说明图1上调基因过表达菌株的SDS-PAGE图谱。图2下调基因敲除菌株与对照菌株在有机溶剂压力下的菌落形成效率比对。具体实施方式实施例1丁醇耐受菌株和对照菌株总RNA的提取和基因芯片数据处理将丁醇耐受菌株大肠杆菌E.coli JM109/pHACMB8和对照菌株在0.8％(v/v)丁醇浓度下培养1.5h后，4℃，8000r·min-1收集菌体，用液氮快速研磨菌体，用Trizol试剂洗脱并收集胞内物质。通过电泳质检后使用QIAGEN RNeasy mini kit和RNase-Free DNase Set试剂盒对总RNA进行纯化。每个样品分别包含三个生物学重复。将样品储藏于干冰中送至上海伯豪生物技术有限公司进行基因芯片杂交实验。完成杂交的芯片采用Agilent Microarray Scanner进行扫描，用Feature Extraction software 10.7读取数据，最后采用Gene Spring Software 11.0对数据进行归一化处理。使用分子网络注释系统(Bioknow-Molnet)通过与KEGG PATHWAY数据库(http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway.html)相偶联，可以将基因芯片中的差 异基因进行功能注释和代谢通路富集分析。将一组功能相关或者相近的基因集合归类，获得与丁醇耐受密切相关的代谢通路。KEGG数据库对差异基因的富集结果见表1。表1基因芯片差异基因KEGG代谢通路富集分析实施例2上调基因的过表达菌株的构建将E.coli JM109/pQE80L接种于LB/Kan液体培养基中，37℃培养10h后，提取pQE80L质粒，并用限制性内切酶Bam HI和Hind III于37℃双酶切3h后，柱回收以获得纯化的线性化质粒。以E.coli JM109基因组为模板，用带有同样酶切位点的上调基因引物进行PCR，PCR体系如下：PCR程序：95℃ 5min，98℃ 10s，55℃ 15s，72℃ 2min 30s反应30个循环，72℃ 10min，16℃ 30s。对获得相关上调基因的PCR产物片段用PCR产物回收试剂盒进行纯化，用Bam HI和Hind III双酶切上调基因的回收片段，按照连接体系说明书，向体系中加入适当浓度的载体和片段。16℃过夜连接，连接体系如下：将过夜连接的反应液按化学热转法转至E.coli JM109感受态细胞，后培养1.5h，涂布于LB/Kan平板，37℃培养12h，挑取平板上的单菌落，以pQE通用引物进行菌落PCR验证。将阳性克隆株接种于30mL LB/Kan液体培养基中，37℃，120rpm培养至OD660约为0.6时加入终浓度为0.2mmol·L-1的IPTG，30℃，120rpm诱导4h。8800×g离心10m本文档来自技高网...
【技术保护点】
采用基因芯片分析在丁醇胁迫条件下大肠杆菌E.coli JM109/pHACMB8和对照菌株的基因组转录水平差异，鉴定与丁醇耐受性相关的基因yibT和yghW，以及相关代谢途径，其特征在于：(1)基因yibT和yghW编码假定蛋白，参与细胞膜不饱和脂肪酸含量的调控，特别是C16:1和C18:1。(2)和对照菌株相比，基因yibT和yghW的敲除菌株的丁醇耐受性显著提高。(3)大肠杆菌E.coli JM109/pHACMB8的丁醇耐受性主要涉及乙醛酸二羧酸，丙酸，丙酮酸，氧化磷酸化，糖和氨基酸代谢途径，以及ABC转运系统。(4)大肠杆菌E.coli JM109/pHACMB8携带σ70突变基因rpoDM2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
【技术特征摘要】
1.采用基因芯片分析在丁醇胁迫条件下大肠杆菌E.coli JM109/pHACMB8和对照菌株的基因组转录水平差异，鉴定与丁醇耐受性相关的基因yibT和yghW，以及相关代谢途径，其特征在于：(1)基因yibT和yghW编码假定蛋白，参与细胞膜不饱和脂肪酸含量的调控，特别是C16:1和C18:1。(2)和对照菌株相比，基因yib...
【专利技术属性】
技术研发人员：倪晔，韩瑞枝，许国超，董晋军，司海明，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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