含有突变的lpdA基因的大肠杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及通过遗传工程改造大肠杆菌的领域。具体而言，本发明专利技术提供了一种含有突变的lpdA基因的大肠杆菌。本发明专利技术还涉及使用所述大肠杆菌用于生产如乙醇和丁二酸等化工原料的用途。本发明专利技术还提供了使用所述大肠杆菌生产乙醇和丁二酸等化工原料的方法，以及通过引入突变的lpdA基因而提高大肠杆菌中丙酮酸脱氢酶活性的方法。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及通过遗传工程改造大肠杆菌的领域。具体而言，本专利技术提供了一种含有突变的lpdA基因的大肠杆菌。本专利技术还涉及使用所述大肠杆菌用于生产如乙醇和丁二酸等化工原料的用途。本专利技术还提供了使用所述大肠杆菌生产乙醇和丁二酸等化工原料的方法，以及通过引入突变的lpdA基因而提高大肠杆菌中丙酮酸脱氢酶活性的方法。【专利说明】含有突变的IpdA基因的大肠杆菌及其应用专利
本专利技术涉及通过遗传工程改造大肠杆菌的领域。具体而言，本专利技术提供了一种含有突变的IpdA基因的重组大肠杆菌。本专利技术还涉及使用所述大肠杆菌用于生产如乙醇、丁二酸、丁醇和1，3-丙二醇等化工原料的用途。本专利技术还提供了使用所述大肠杆菌生产乙醇和丁二酸等化工原料的方法，以及通过引入突变的IpdA基因而提高大肠杆菌中丙酮酸脱氢酶活性的方法。专利技术背景微生物发酵法生产化工原料(如乙醇、丁二酸等)近来取得了很大的进展。与传统的化学方法相比，微生物发酵法具有很多优势，例如高生产率、低成本、以及利用可再生的原料而非石油化工产品等。在微生物发酵生产中，大肠杆菌(E.coli)由于其遗传背景清楚、易操作、易调控、易培养、生长迅速等优点，被广泛用于研究以获得高产菌株。大肠杆菌在缺氧条件下，通常消耗糖或其衍生物，并发酵产生甲酸、乙酸、乳酸、丁二酸、乙醇等产物。野生型大肠杆菌生产乙醇和丁二酸等的产率通常较低。近年来的研究表明，对大肠杆菌的代谢途径中所涉及的酶进行遗传改造，可以获得相应的高产菌株。丙酮酸脱氢酶复合物(TOH)在大肠杆菌代谢途径中发挥重要的作用。丙酮酸脱氢酶是三个酶的复合物，催化丙酮酸不可逆氧化脱羧转化成乙酰辅酶A(acetyl-C0A)，同时将NAD+还原为NADH。乙酰辅酶A可继而被用于柠檬酸循环以进行细胞呼吸作用(cellular respirat1n)。 丙酮酸脱氢酶复合物将糖酵解代谢途径与柠檬酸循环联系起来。丙酮酸脱羧也称作“丙酮酸脱氢反应”，因为其中也涉及了丙酮酸的氧化(Hansen etal.，1996B1chim B1phys Actal22:355 - 358;Bisswanger1981J B1l Chem256:815 -822;Quail et al.，1994J Mol Microb1ll2:95_104)。在微生物厌氧发酵过程中，NAD和NADH是维持氧化还原反应的重要辅因子，其中NAD是重要的电子受体，而NADH则是电子传递过程中重要的辅因子，它决定着反应过程中还原力的供给(Garrigues et al., 1997J Bacter1l 179:5282 - 5287;Cassey etal., 1998FEMS Microb1l Lettl59:325-329)。在糖酵解过程中一分子葡萄糖产生两分子的NADH，而丙酮酸脱羧过程中，一分子葡萄糖可以产生两分子的乙酰辅酶A，并且伴随四分子的NADH产生(glucose — 2acety1-CoA — 4NADH),这相对于丙酮酸转化为甲酸的过程多产生了两分子的NADH，增加了还原力的供给，所以提高丙酮酸脱羧反应中丙酮酸脱氢酶(PDH)的活力，对提高代谢过程中的还原力供给有很重要的意义。PDH作为连接糖酵解和三羧酸循环(TCA)的重要酶，其在好氧条件下酶活较高，但在厌氧条件下酶活很低。PDH复合物所催化生成的产物乙酰辅酶A与NADH，能够抑制丙酮酸脱氢酶复合物的作用能力。NADH是用于微生物生物合成的重要的还原力来源，但是高浓度的NADH却会抑制丙酮酸脱氢酶复合物的活性，成为代谢路径中关键的限速酶。Kim(Kimet al., 2008J Bacter1ll90:3851 - 3858)筛选得到了 I3DH复合体中的二氢硫辛酰胺脱氢酶(LPD)突变株E354K (IpdlOl)使PDH在无氧条件下对NADH抑制的敏感性显著下降，提高了利用该途径生产乙醇的能力。Zhou (Zhou et al., 2008B1technol Lett30:335-342)等的研究也表明，Ipd突变的引入和对aceEF基因调控提高了丙酮酸脱氢酶(TOH)的活性，提高发酵过程中菌株的生长及产量。为了提高大肠杆菌生产化工原料的产量和/或转化率，需要进一步对大肠杆菌的代谢途径进行改造。专利技术概述一方面，本专利技术提供了一种经工程化的重组大肠杆菌。在一个实施方案中，本专利技术提供了一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌含有突变的IpdA基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列如下位置的一个或多个位置上含有修饰:T81、P275和A358，对应的位置是通过与SEQ ID N0.:1进行序列比对而确定的，其中在对应于T81的位置上的修饰是用I置换T，在对应于P275的位置上的修饰是用S置换P，以及在对应于A358的位置上的修饰是用V置换A。在一个优选的实施方案中，所述大肠杆菌中所述突变的IpdA基因的表达增强、和/或所述突变的IpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。在一个实施方案中，本专利技术提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的IpdA基因，其中所述突变的IpdA基因在对应于SEQ ID N0.: 2所示核苷酸序列如下位置的一个或多个位置上含有突变:C242、C823和C1073，对应的位置是通过与SEQ ID N0.:2进行序列比对而确定的，并且其中所述突变均是用T置换C。在一个优选的实施方案中，所述大肠杆菌中所述突变的IpdA基因的表达增强、和/或所述突变的IpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。在一个实施方案中，本专利技术提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的IpdA基因，其中所述突变的IpdA基因所编码的多肽在对应于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列的A358的位置上含有修饰，并且在对应于A358的位置上的修饰是用V置换A。在一个实施方案中，本专利技术提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的IpdA基因，其中所述突变的IpdA基因在对应于SEQ ID N0.: 2所示核苷酸序列的C1073的位置上含有突变，并且其中所述突变是用T置换C。在一个实施方案中，本专利技术提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的IpdA基因，其中所述突变的IpdA基因所编码的多肽在对应于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列的T81、P275和A358的位置上都含有修饰，其中在对应于T81的位置上的修饰是用I置换T，在对应于P275的位置上的修饰是用S置换P，以及在对应于A358的位置上的修饰是用V置换A。在一个实施方案中，本专利技术提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的IpdA基因，其中所述突变的IpdA基因在对应于SEQ ID N0.: 2所示核苷酸序列的C242、C823和C1073的位置上都含有突变，并且其中所述突变均是用T置换C。在优选的实施方案中，本专利技术的大肠杆菌中所含有的突变的IpdA基因的活性增强。在一个实施方案中，本专利技术的大肠杆菌中含有突变的IpdA基因，并且所述突变的IpdA基因位于质粒中或者整合至染色体中。在一个实施方案中，本专利技术的大肠杆菌还含有如下的修饰:磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的基因表达的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑制；p本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌还含有突变的lpdA基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:1所示氨基酸序列如下位置的一个或多个位置上含有修饰：T81、P275和A358，对应的位置是通过与SEQ ID No.:1进行序列比对而确定的，其中在对应于T81的位置上的修饰是用I置换T，在对应于P275的位置上的修饰是用S置换P，以及在对应于A358的位置上的修饰是用V置换A，任选地，所述大肠杆菌中所述突变的lpdA基因的表达增强、和/或所述突变的lpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张学礼，朱欣娜，陈晶，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12