一种降解烟叶中叶绿素的方法技术

本发明专利技术属于烟草制备技术领域，具体涉及一种利用拟南芥叶绿素酶AtCLH1基因降解烟叶中叶绿素方法的专利申请。该方法首先将AtCLH1基因整合进入大肠杆菌基因组中构建重组菌株，然后扩增该重组菌株制备处理菌剂，再将该菌剂喷施于烟叶表面，并适当发酵即可。实验表明，供试烟叶经处理后，烟叶中的叶绿素得以快速降解，叶绿素含量得到了明显降低，降解率可达20%以上，使烟叶化学成分更为协调。由于该处理方法技术较为成熟，处理成本较低，且处理周期较短，而对烟叶质量改善较为明显，能够明显提升烟叶品质（尤其是低次烟叶品质提升较为明显），因而在烟草制备领域具有较好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于烟草制备
，具体涉及一种利用拟南芥叶绿素酶AtCLH1基因降解烟叶中叶绿素方法的专利申请。
技术介绍
叶绿素是高等植物进行光合作用、吸收光能和光能转化的主要色素类物质，包括叶绿素a、叶绿素b、脱镁叶绿素等几种类型；叶绿素也是烟草生长过程中烟叶进行碳氮代谢的基础。一般而言，在烟叶成熟和调制过程中，烟叶中所含叶绿素会大量降解，其降解率可达99%，通常仅以痕量存在。但受限于烟草处理方式的工艺差别，烟叶中叶绿素降解不够充分的现象也偶有存在。当烟叶中叶绿素降解不完全时，烟叶烤后易形成不同程度的“青黄烟”，这种烟叶在燃吸时，会产生明显的青杂气，进而严重影响烟叶的外观品质与内在品质。由于叶绿素降解是否充分对烟草品质具有十分重要的潜在影响，因而极有必要采取适当措施以确保烟叶中叶绿素降解充分。叶绿素酶是一种普遍存在于高等植物中，介导叶绿素降解反应的关键酶之一，主要位于植物叶绿体内膜上，质体外也有所分布。该酶由叶绿素酶基因编码，目前已经克隆出的叶绿素酶基因共有4种，分别是藜叶绿素酶基因CaCLH、柑桔叶绿素酶基因CHLASE1和拟南芥叶绿素酶基因AtCLH1、AtCLH2。但现有研究中，尚未见到较好的商品化的叶绿素酶产品，及将相关叶绿素酶基因用于降解烟草中叶绿素的有关报道。
技术实现思路
本专利技术目的在于通过合理利用拟南芥叶绿素酶AtCLH1基因，从而确保烟叶中的叶绿素降解完全，进而确保烟叶品质的稳定。本申请所采取的技术方案详述如下。一种降解烟叶中叶绿素的方法，该方法利用拟南芥叶绿素酶AtCLH1基因进行烟叶中叶绿素的降解，其技术思路为：该方法首先将该基因整合进入大肠杆菌基因组中构建重组菌株，然后扩增该重组菌株制备处理菌剂，再将该菌剂喷施于烟叶表面，并适当发酵即可，具体包括如下步骤：（1）克隆获得拟南芥叶绿素酶AtCLH1基因，具体为：取新鲜拟南芥叶，Trizol法提取总RNA，并反转录为cDNA；设计引物，并以上制备的cDNA为模板进行PCR扩增，获得拟南芥叶绿素酶AtCLH1基因扩增产物；（2）构建重组表达载体，具体为：利用EcoRI和XhoI酶对步骤（1）中扩增所得拟南芥叶绿素酶AtCLH1基因的扩增产物进行双酶切，回收酶切产物；利用EcoRI和XhoI酶对pET28a质粒进行双酶切，回收酶切产物；利用T4DNA连接酶将AtCLH1基因和pET28a质粒的酶切产物进行连接构建重组质粒pET28a-AtCLH1；将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化后涂布进行抗性筛选；挑取单菌落进行菌落PCR鉴定与双酶切验证后，筛选验证正确的阳性克隆进行质粒提取获得大量的构建正确的重组表达载体pET28a-AtCLH1，备用；（3）构建重组工程菌，具体为：将步骤（2）中所提取重组表达载体pET28a-AtCLH1转化大肠杆菌BL21感受态细胞，经筛选、鉴定后获得转化正确的重组工程菌；（4）菌株扩增与诱导表达，具体为将步骤（3）中构建正确的重组工程菌转接于LB液体培养基中，37℃、220rpm摇床培养，培养至OD600=0.6左右；然后加入终浓度为0.5mM/L的IPTG，30℃继续诱导培养12h；离心收集菌体，并加入离心前等体积LB液体培养基进行重悬，此时即可作为烟叶处理用菌剂；（5）烟叶处理，具体为：将步骤（4）中所制备菌剂按烟叶质量0.7%~1.0%的比例，均匀喷洒与烟叶表面，然后在37℃、60%湿度条件下贮藏10d，即可快速和有效的降解烟叶中叶绿素。本专利技术中所述烟叶为新鲜采摘或经烘烤、晾晒、发酵的烟叶，尤其适用于青黄烟、微带青烟等叶绿素含量较高的低次烟叶。从另一个角度而言，本申请主要涉及拟南芥叶绿素酶AtCLH1基因在降解烟叶中叶绿素方面的应用的专利申请，利用该基因可有效降解烟叶中的叶绿素成分。本专利技术采用分子生物学方法，将拟南芥叶绿素酶基因AtCLH1进行克隆，构建了表达载体pET28a-AtCLH1，将其转化大肠杆菌后，从而获得了特定表达叶绿素酶的重组工程菌株。将该重组工程菌株扩增并诱导表达后，即可用于处理烟叶。实验表明，供试烟叶经处理后，烟叶中的叶绿素得以快速降解，叶绿素含量得到了明显降低，降解率可达20%以上，使烟叶化学成分更为协调。由于该处理方法技术较为成熟，处理成本较低，且处理周期较短，而对烟叶质量改善较为明显，能够明显提升烟叶品质（尤其是低次烟叶品质提升较为明显），因而在烟草制备领域具有较好的应用前景。附图说明图1为AtCLH1基因片段的PCR产物电泳图；其中M:TransDNAmarkerIII；1为AtCLH1基因片段的扩增产物；图2为表达载体pET28a-AtCLH1的鉴定图；其中M:TransDNAmarkerIII；A为菌落PCR鉴定结果；B为双酶切鉴定结果；图3为目的蛋白AtCLH1的SDS-PAGE电泳图；其中M：Marker，蛋白标准分子量；1：对照组，为含有空载体pET28a的大肠杆菌（E.coli）全细胞液；2~6：为含有表达载体pET28a-AtCLH1的E.coli全细胞液，其中2~6的IPTG浓度依次为0.2mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L；图4为不同处理时间下烟叶叶绿素降解率变化图。具体实施方式下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分物料、实验试剂、实验设备等背景情况简要介绍如下。生物材料：拟南芥为Columbia0野生型，由上海交通大学生命科学技术学院许平教授惠赠；质粒pET28a、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21等均购自天根生化科技有限公司；烟叶样品为2014年河南南阳GY1（青黄烟1级），由河南中烟工业有限责任公司提供；相关引物合成及测序由上海博尚生物技术有限公司进行。实验试剂：LB液体培养基配方为：每1000mL去离子水中含有：酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCL10g，用NaOH溶液调pH为7.0；LB固体培养基配方为：每1000mL去离子水中含有：琼脂粉15g，酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCL10g，用NaOH溶液调pH为7.0；培养基在使用前于121℃灭菌15min。Trizol试剂、反转录试剂盒、EcoRI、XhoI酶等均购自宝生物工程有限公司。实验设备：5417R高速冷冻离心机，为德国Eppendorf公司产品；UV-2550紫外分光光度计，为Shimadzu公司产品；DYCZ-20F电泳仪，为北京六一生物科技有限公司产品；VeritiDX96PCR仪，为AppliedBiosystems公司产品。实施例1由于利用拟南芥叶绿素酶AtCLH1基因构建重组菌株是本申请的关键过程，因而本实施例就该重组菌株的构建过程简要介绍如下。（1）克隆获得拟南芥叶绿素酶AtCLH1基因，具体为：取生长10~15d的新鲜拟南芥叶片约100mg，放入液氮预冷过的研钵中，迅速将叶片研磨成粉末，将粉末转移至1.5mL离心管中，采用Trizol法进行总RNA的提取，并对提取的拟南芥总mRNA进行反转录获得cDNA。从基因数据库中获取拟南芥叶绿素酶基因AtCLH1全长CDS序列（碱基序列如SEQIDNO.1所示），以此为基础，设计如下引物对，引物1：本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种降解烟叶中叶绿素的方法，其特征在于，该方法利用拟南芥叶绿素酶AtCLH1基因进行烟叶中叶绿素的降解，具体包括如下步骤：（1）PCR克隆获得拟南芥叶绿素酶AtCLH1基因，（2）构建重组表达载体pET28a‑AtCLH1；（3）构建重组工程菌，具体为：将步骤（2）中重组表达载体pET28a‑AtCLH1转化大肠杆菌BL21感受态细胞，经筛选、鉴定后获得转化正确的重组工程菌；（4）菌株扩增与诱导表达，具体为：将步骤（3）中构建正确的重组工程菌转接于LB液体培养基中，培养，并加入IPTG诱导表达；诱导表达结束后，离心收集菌体，并加入LB液体培养基进行重悬，以此可作为烟叶处理用菌剂；（5）烟叶处理，具体为：将步骤（4）中所制备菌剂均匀喷洒于烟叶表面。

【技术特征摘要】
1.一种降解烟叶中叶绿素的方法，其特征在于，该方法利用拟南芥叶绿素酶AtCLH1基因进行烟叶中叶绿素的降解，具体包括如下步骤：（1）PCR克隆获得拟南芥叶绿素酶AtCLH1基因，（2）构建重组表达载体pET28a-AtCLH1；（3）构建重组工程菌，具体为：将步骤（2）中重组表达载体pET28a-AtCLH1转化大肠杆菌BL21感受态细胞，经筛选、鉴定后获得转化正确的重组工程菌；（4）菌株扩增与诱导表达，具体为：将步骤（3）中构建正确的重组工程菌转接于LB液体培养基中，培养，并加入IPTG诱导表达；诱导表达结束后，离心收集菌体，并加...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨宗灿，张展，马宇平，陈芝飞，于建春，彭玉富，周浩，郝辉，聂聪，
申请(专利权)人：河南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：河南;41