用于从生物质材料生产乙醇的乳酸菌制造技术

本发明专利技术公开了乳酸菌培养物、细胞群和包括所述乳酸菌培养物、细胞群的制品以从木质素纤维素生产乙醇。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
和背景在本专利技术的一些实施方案中，本专利技术涉及通过联合生物加工方法（consolidated bioprocessing approach）从生物质材料生产乙醇的方法和重组乳酸菌。乙醇是一种已证实的来自再生资源的替代燃料。现今主要从糖或淀粉生物质生产，限制了环境益处，并造成对食品工业的原材料的竞争。在过去十年来，已发起了用由木质素纤维素原料生产的第2代乙醇替代这种第1代乙醇的研究努力，其包括预处理、酶促水解、糖发酵和工艺设计。朝着工业规模开发的大多数工艺方法包括加入用于纤维素和半纤维素水解的酶和使用经改造利用C5和C6糖的特定酵母菌株。实现有效生物质水解和完全糖转化两者对于经济的工艺是必不可少的。虽然酶生产商在近年来已实现了重大改进，但是纤维素酶的成本仍在$0.5-$1.0/加仑第2代乙醇的范围内。旨在规避这一关键性成本增加项目的方法策略是联合生物加工方法。在CBP中，生物体或生物体的混合培养物产生用于水解木质素纤维素生物质中的纤维素和半纤维素的酶，并在不加入纤维素分解酶或半纤维素分解酶的情况下使C5和C6糖发酵成乙醇或其它有价值的产品。几种具有经改造的纤维素酶活性的嗜温和嗜热纤维素分解微生物以及非纤维素分解微生物正在研发中用于CBP的应用[Olson DG等, Curr Opin Biotechnol 2011, 23:1-10；La Grange DC Appl Microbiol Biotechnol 2010, 87:1195-1208；Svetlitchnyi等, Biotechnology for Biofuels 2013, 6:31]。木质素纤维素转化成乙醇需要耐乙醇微生物，其能够将木质素纤维素降解成可发酵糖并使由于木质素纤维素生物质水解所致而释放的各种糖(戊糖和己糖)发酵。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是一种用于各种工业和农业应用的常见乳酸菌。植物乳杆菌在含有木质素纤维素植物生物质的环境中茂盛生长。例如，在农业上，这些生物用于保存木质素纤维素植物生物质以用于动物饲料。在称为秣草保藏法的过程中，它们快速在微生物群中占首要地位，并产生乳酸和乙酸，因此引起pH下降，这抑制了其它微生物和真菌物种。据报道，这种细菌对培养基中的乙醇浓度具有高耐受性(高达13% (v/v))。植物乳杆菌还能够代谢来源于木质素纤维素生物质的戊糖和己糖。这些特性提供这样的细菌，其具有超过常用的产乙醇酵母，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的明显的优势，在其天然形式下，所述酿酒酵母不代谢戊糖。另一个优势是其耐酸性，这使得能够在低pH下产生乙醇，因此减少由其它细菌和真菌引起的可能污染，并由于有时通过预处理程序强加的酸性条件而节约处理步骤。此外，这些细菌的分子生物学的最新研发包括新的蛋白质表达系统和植物乳杆菌全基因组序列的可得性。方便的遗传操作和稳健的外源基因表达使这些细菌的遗传操作成为可完成的任务。美国专利申请号20100129885教导了经遗传修饰以表达纤维素酶和作为丁醇生物合成途径的一部分的酶的微生物(包括植物乳杆菌)。美国专利申请号20120190090教导了经遗传修饰以表达纤维素酶和作为丁醇生物合成途径的一部分的酶的微生物。Solem等[Appl. Environ. Microbiol. 2013, 79(8):2512]教导了用于乙醇生产的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的遗传工程。其它
技术介绍
包括美国专利申请号20110230682。专利技术概述按照本专利技术的一些实施方案的一个方面，提供包含生物质成分和乳酸菌群的细菌培养物，其包含：(i) 经遗传修饰以表达分泌的纤维素酶的第一乳酸菌群；(ii) 经遗传修饰以表达分泌的木聚糖酶的第二乳酸菌群，其中选择第一群:第二群的比率使得培养物中纤维素酶:木聚糖酶的比活大于4:1或小于1:4；和(iii) 经遗传修饰以产生乙醇的第三乳酸菌群。按照本专利技术的一些实施方案的一个方面，提供包含生物质成分和乳酸菌群的细菌培养物，其包含：(i) 经遗传修饰以表达分泌的纤维素酶的第一乳酸菌群；(ii) 经遗传修饰以表达分泌的木聚糖酶的第二乳酸菌群，其中选择第一群:第二群的比率使得培养物中纤维素酶:木聚糖酶的比活大于4:1或小于1:4，其中第一乳酸菌群和/或第二乳酸菌群被进一步遗传修饰以产生乙醇。按照本专利技术的一些实施方案的一个方面，提供包含以下的制品：(i) 经遗传修饰以表达至少一种纤维溶解酶(fibrolytic enzyme)的第一乳酸菌群；和(ii) 经遗传修饰以从C5或C6糖产生乙醇的第二乳酸菌群，其中将第一乳酸菌群和第二乳酸菌群包装在单独的包装中。按照本专利技术的一些实施方案的一个方面，提供包含以下的分离的细胞群：(i) 经遗传修饰以表达至少一种纤维溶解酶的第一乳酸菌群；和(ii) 经遗传修饰以从C5或C6糖产生乙醇的第二乳酸菌群。按照本专利技术的一些实施方案的一个方面，提供经遗传修饰以表达至少一种纤维溶解酶且从C5或C6糖产生乙醇的乳酸菌的分离的细胞群。按照本专利技术的一些实施方案的一个方面，提供包含本文所述分离的细胞群和生物质成分的细菌培养物。按照本专利技术的一些实施方案的一个方面，提供生产乙醇的方法，所述方法包括在允许乙醇产生的条件下使本文所述培养物增殖，从而产生乙醇。按照本专利技术的一些实施方案，第一乳酸菌群表达纤维素酶。按照本专利技术的一些实施方案，制品另包含经遗传修饰以表达木聚糖酶的第三乳酸菌群。按照本专利技术的一些实施方案，至少一种纤维溶解酶作为与dockerin的融合蛋白表达。按照本专利技术的一些实施方案，乳酸菌包含植物乳杆菌。按照本专利技术的一些实施方案，生物质成分包含纤维素和/或半纤维素。按照本专利技术的一些实施方案，生物质另包含木质素。按照本专利技术的一些实施方案，生物质选自纸、纸制品、废纸、木、碎料板、锯屑、农业废料、污水、青贮饲料、草、稻壳、甘蔗渣、黄麻、大麻、亚麻、竹、剑麻、马尼拉麻、麦秆、玉米芯、玉米秸草、柳枝稷、苜蓿、干草、椰子棕、棉、海草、藻类及其混合物。按照本专利技术的一些实施方案，选择第一群:第二群的比率使得培养物中纤维素酶:木聚糖酶的比活大于10:1或小于1:10。按照本专利技术的一些实施方案，至少一种纤维溶解酶包含纤维素酶和/或木聚糖酶。按照本专利技术的一些实施方案，至少一种纤维溶解酶是纤维素酶。按照本专利技术的一些实施方案，分离的细胞群另包含经遗传修饰以表达木聚糖酶的第三乳酸菌群。按照本专利技术的一些实施方案，第一乳酸菌群包含植物乳杆菌。按照本专利技术的一些实施方案，第二乳酸菌群包含植物乳杆菌。按照本专利技术的一些实施方案，第三乳酸菌群包含植物乳杆菌。按照本专利技术的一些实施方案，乳酸菌包含植物乳杆菌。按照本专利技术的一些实施方案，纤维素酶是褐色喜热裂孢菌(Thermobifida fusca)纤维素酶。按照本专利技术的一些实施方案，木聚糖酶是褐色喜热裂孢菌木聚糖酶。按照本专利技术的一些实施方案，纤维素酶是中温菌纤维素酶。按照本专利技术的一些实施方案，木聚糖酶是中温菌木聚糖酶。按照本专利技术的一些实施方案，中温菌是生黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)或白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)。按本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含生物质成分和乳酸菌群的细菌培养物，其包含：(i) 经遗传修饰以表达分泌的纤维素酶的第一乳酸菌群；(ii) 经遗传修饰以表达分泌的木聚糖酶的第二乳酸菌群，其中选择第一群:第二群的比率使得所述培养物中纤维素酶:木聚糖酶的比活大于4:1或小于1:4；和(iii) 经遗传修饰以产生乙醇的第三乳酸菌群。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种包含生物质成分和乳酸菌群的细菌培养物，其包含：(i) 经遗传修饰以表达分泌的纤维素酶的第一乳酸菌群；(ii) 经遗传修饰以表达分泌的木聚糖酶的第二乳酸菌群，其中选择第一群:第二群的比率使得所述培养物中纤维素酶:木聚糖酶的比活大于4:1或小于1:4；和(iii) 经遗传修饰以产生乙醇的第三乳酸菌群。2.一种包含生物质成分和乳酸菌群的细菌培养物，其包含：(i) 经遗传修饰以表达分泌的纤维素酶的第一乳酸菌群；(ii) 经遗传修饰以表达分泌的木聚糖酶的第二乳酸菌群，其中选择第一群:第二群的比率使得所述培养物中纤维素酶:木聚糖酶的比活大于4:1或小于1:4，其中所述第一和/或所述第二乳酸菌群被进一步遗传修饰以产生乙醇。3. 一种制品，其包含：(i) 经遗传修饰以表达至少一种纤维溶解酶的第一乳酸菌群；和(ii) 经遗传修饰以从C5或C6糖产生乙醇的第二乳酸菌群，其中所述第一乳酸菌群和所述第二乳酸菌群在单独的包装中包装。4.权利要求3的制品，其中所述第一乳酸菌群表达纤维素酶。5.权利要求4的制品，其另包含经遗传修饰以表达木聚糖酶的第三乳酸菌群。6. 权利要求1-3中任一项的培养物或制品，其中所述乳酸菌包含植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。7. 一种分离的细胞群，其包含：(i) 经遗传修饰以表达至少一种纤维溶解酶的第一乳酸菌群；和(ii) 经遗传修饰以从C5或C6糖产生乙醇的第二乳酸菌群。8.权利要求3或7的制品或分离的细胞群，其中所述至少一种纤维溶解酶作为与dockerin的融合蛋白表达。9.一种分离的乳酸菌细胞群，其经遗传修饰以表达至少一种纤维溶解酶且从C5或C6糖产生乙醇。10.一种细菌培养物，其包含权利要求9的分离的细胞群和生物质成分。11.权利要求1-2和10中任一项的培养物，其中所述生物质成分包含纤维素和/或半纤维素。12.权利要求1-2和10中任一项的培养物，其中所述生物质另包含木质素。13.权利要求1-2和10中任一项的培养物，其中所述生物质选自纸、纸制品、废纸、木、碎料板、锯屑、农业废料、污水、青贮饲料、草、稻壳、甘蔗渣、黄麻、大麻、亚麻、竹、剑麻、马尼拉麻、麦秆、玉米芯、玉米秸草、柳枝稷、苜蓿、干草、椰子棕、棉、海草、藻类及其混合物。14.权利要求1或2的培养物，其中选择第一群:第二群的比率使得所述培养物中纤维素酶:木聚糖酶的比活大于10:1或小于1:10。15. 权利要求3、7或9中任一项的制品或分离的细胞群，其中所述至少一种纤维溶解酶(fibrolytic enzyme)包含纤维素酶和/或木聚糖酶。16.权利要求7的分离的细胞群，其中所述至少一种纤维溶解酶是纤维素酶。17.权利要求16的分离的细胞群，其另包含经遗传修饰以表达木聚糖酶的第三乳酸菌群。18.权利要求1、2或7的培养物或分离的细胞群，其中所述第一乳酸菌群包含植物乳杆菌。19.权利要求7或18的分离的细菌细胞群的培养物，其中所述第二乳酸菌群包含植物乳杆菌。20.权利要求1或17的培养物或分离的细菌细胞群...

【专利技术属性】
技术研发人员：I米兹拉希，N斯特泽，R拉梅德，I罗兹曼格林伯格，EA巴耶，S莫濑斯，E兰道，
申请(专利权)人：以色列国家农业和农村发展农业研究组织沃尔坎尼中心，耶达研究及发展有限公司，特拉维夫大学拉莫特有限公司，
类型：发明
国别省市：以色列;IL