本发明专利技术公开了一种产角蛋白酶大肠杆菌基因工程菌及其应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术采用重组DNA技术将地衣芽胞杆菌Bacillus?licheniformis?BBE11-1的角蛋白酶（ker）基因克隆连接到大肠杆菌表达载体pET?22b(+)，并转化Escherichia?coli?BL21(DE3)，经筛选鉴定得到一株可以产较高角蛋白酶的重组枯草芽孢杆菌Escherichia?coliBL21(DE3)-pET22b(+)-ker，保藏编号为CCTCC?NO：M?2012180。该菌株表达的角蛋白酶酶活为256U/mL，这为角蛋白酶的大规模生产奠定了良好的基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种产角蛋白酶的基因工程菌及其应用，属于基因工程
技术介绍
角蛋白酶(Keratinase)是一种可以特异性降解角蛋白的酶类，由细菌、放线菌和真菌等多种微生物产生。羽毛作为家禽饲养和屠宰工业的副产物每年产量巨大，且蛋白质和氨基酸含量丰富，是潜在的优良蛋白质资源。羽毛的合理利用一方面可以减少废弃物对环境的污染，同时可以作为一种饲科蛋白质应用于畜禽的饲养。在传统利用羽毛过程中主要采用酸碱水解。热降解等方法，前者存在污染环境问题，后者对能源消耗比较大，且可以破坏部分氨基酸，降低了产品的营养价值。其他常见的角蛋白为动物的毛发，如牛毛、羊毛和人发等，这类角蛋白质部分作为商业原料进行加工外，其余多作为废物处理，也造成了 环境的污染和蛋白资源的浪费。角蛋白酶能使角蛋白降解为多肽和氨基酸，既可用于农业肥料的生产，又可作为畜禽的饲料蛋白源；角蛋白酶是皮肤真菌重要的侵袭因子，其在皮肤病治疗方面的研究还有待于进一步挖掘。另外，角蛋白酶可“消化”导致疯牛病和人类克雅氏症的毒蛋白，从而可应用于医疗和实验仪器的净化；它还可用于皮革脱毛鞣制，配制润肤露、浴皂、洗发水和脱毛膏等美容品。目前关于角蛋白酶的研究主要集中于生产菌株的筛选以及相关酶性质的研究。然而，在这些角蛋白酶产生菌中只有很少的菌株具有商业开发价值。在异源宿主中表达也存在许多问题需要解决，如表达蛋白以包涵体形式出现；这种异源表达的蛋白有时会对宿主菌产生毒性，限制宿主菌的生长，而且，在表达量积累的过程中，这种碱性蛋白酶还会造成自身的降解；构建的重组质粒有时很不稳定，在表达过程中容易丢失，这样就造成蛋白表达量的降低或消失。构建合适的载体和选择正确的宿主是这类蛋白表达的关键。
技术实现思路
本专利技术提供了一种产角蛋白酶大肠杆菌基因工程菌，已于2012年5月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉、武汉大学，保藏编号为CCTCC NO M2012180，分类学命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)-pET22b (+)-ker。本专利技术还提供了一种应用所述基因工程菌发酵生产角蛋白酶的方法，以产角蛋白酶基因工程菌为生产菌株，斜面活化制备种子，在种子0D_在2. 5时以3%的接种量转入基本发酵培养基，于20°C、200rpm条件下培养；当OD值再为2. 5时，降低发酵温度到20°C诱导30小时，IPTG浓度为O. 05mM ;种子和斜面培养基为LB培养基；基本发酵培养基成分为去离子水900mL，胰蛋白胨12g，酵母抽提物24g，甘油10mL，高压灭菌，冷却至60°C，加IOOmL灭菌磷酸钾缓冲液。角蛋白酶酶活测定方法将发酵液离心IOmin (10000X g，4°C )取发酵上清液，吸取200uL适当稀释的酶液，加入300uL O. 05mol/L gly-NaOH缓冲液(pH9. O)溶解1%的底物(角蛋白)，50°C培养15min，加入500uL 4M TCA溶液以终止反应。离心lOmin，吸取200uL上清液移入到新的试管中，后依此加入ImL福林酚试剂和200uL O. 5M Na2CO3后50度显色15min。空白为在加入酶液的同时，加入500uL TCA溶液，经过相同过程反应的过滤清液作为空白。在660nm处检测吸光值,根据酪氨酸标准曲线定义每15min内释放Iug酪氨酸定义为一个酶活单位。以本发提供的基因工程菌，在发酵结束后该菌株表达的角蛋白酶酶活为256U/mL，为角蛋白酶的大规模生产奠定了良好的基础。生物材料样品保藏一株高产角蛋白酶大肠杆菌基因工程菌，命名为EscherichiacoliBL21(DE3)-pET22b(+)-ker，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO :M2012180，保藏日期为2011年5月23日。附图说明图I :(a)目的基因的扩增。 M DL 2,000 DNA Marker ;泳道I和泳道2 :ker基因的PCR扩增条带;(b)菌落PCR挑选阳性重组子。M DL 2，000 DNA Marker ;泳道I和泳道2 :阳性重组子；图2 :(a)重组质粒的提取。M:DL 10,000 DNA Marker ;泳道I和泳道2 :重组质粒 pET22b (+)-ker ; (b)双酶切验证。M :DL 10, 000 DNA Marker ;泳道 I :重组质粒pET22b(+)-ker ；泳道2 :重组质粒用Nco I和Xho I双酶切后得到的条带。图3 :蛋白电泳(SDS-PAGE )实验结果。M:蛋白质分子量标准(Protein Molecular Weight Marker) ;1 :含质粒pET22b (+)重组菌；2 :含质粒pET22b (+) -ker重组菌。具体实施例方式实施例I重组菌的构建及鉴定I)根据NCBI网站基因序列设计(GenBank: S78160. 1)，引物序列如下kerl-F:5， ~CATGCCATGGATGCTCAGCCGGCGAAAAAT~3Jkerl-R:5， -CGCCTCGAGTTATTGAGCGGCAGCTTCGA-3’以地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis BBEl (已在本单位专利号为201110343655. 5的专利申请中保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2011319)基因组为模板，克隆角蛋白酶基因。PCR反应体系0. 2mL PCR管中按顺序加入以下试剂5Xprime STAR PCR bufferII (Mg2+Plus) 5μ I; DNTP Mixture 4 μ I;模板 DNA I μ I ;上下游引物各 I μ I ；Taq 酶0.5 μ I ;加双蒸水至终体积为50 μ I。PCR扩增条件94°C预变性5min ;94°C变性30s,61°C退火 15s，72。。延伸 Imin 20s (30 个循环);72°C延伸 IOmin02)以1%琼脂糖凝胶电泳验证并以O. 8%琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物，结果扩增得到与文献报道大小相符的ker基因片段(图Ia-泳道I、泳道2)。3)用限制性内切酶Nco I和Xho I双酶切消化纯化后的ker基因和载体pET22b(+)，用T4DNA连接酶于16°C过夜连接，连接产物用化学转化法转化宿主菌JM109，转化菌液涂布在含有氨苄青霉素(lOOmg/mL)的LB平板上，37 °C过夜培养，以ker I-F和kerl-R为引物进行菌落PCR的方法鉴定阳性克隆子(图Ib-泳道I、泳道2)，最终获得含有ker基因的重组表达质粒pET22b(+)-ker (图2a_泳道I、泳道2)，用双酶切进行验证(图2b-泳道2)。大肠杆菌化学转化为取连接产物5μ I加入到含有ΙΟΟμ I JM109感受态细胞中，充分混匀后，冰浴30min ;将装有混合物的Eppendorf管，42°C水浴热休克90s，然后将Eppendorf管立即转移到冰上冷却2min ；向管中加入600 μ I LB液体培养基,置于370C 200rpm恒温摇床 上培养lh，然后涂布于含有卡那霉素的平板上，37°C向上放置lh，倒置培养12-16本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种产角蛋白酶大肠杆菌基因工程菌，于2012年5月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC？NO：M？2012180。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈坚，刘柏宏，张娟，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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