本发明专利技术公开了提供一种高产恩拉霉素的菌株，同时提供上述菌株的筛选方法，以及提供该菌株在恩拉霉素生产中的应用。本发明专利技术提供的恩拉霉素高产菌株DCS067保藏号是CGMCCNo.6220，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会（CGMCC），保藏日期是2012年6月14日。本发明专利技术所述DCS067菌株将恩拉霉素产率提高了47.80%。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于生产抗生素的菌株，具体地说，涉及一种高产恩拉霉素的菌株及其制备方法和应用。
技术介绍
恩拉霉素是由真杀菌链霉菌(Streptomyces fungicidious)发酵产生的ー种由十几种氨基酸和不饱和脂肪酸结合而成的环状多肽类抗生素。以往用于生产恩拉霉素的杀真菌链霉菌菌株大多是从野生菌株中筛选得到的，其生产水平较低。中国专利ZL201010528367. 2公开了ー种杀真菌链霉菌突变菌株FYFJ03 (保藏号CGMCC No. 4113)，其筛选方法是首先采用5-溴尿嘧啶诱使出发菌株突变，产生突变株，然后采用金黄色葡萄球菌，按照生物效价法对突变株进行筛选，得到高产恩拉霉素的菌株。该方法虽然在一定程度上提高了菌株的生产能力，但是由于仅采用了化学诱变，且筛选方式単一，因此菌株生产能 力的提闻有限。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高产恩拉霉素的菌株，同时提供上述菌株的筛选方法，以及提供该菌株在恩拉霉素生产中的应用。为实现本专利技术目的，本专利技术提供了一种分类名称是杀真菌链霉菌(Streptomycesfungicidious) DCS067 (以下简称DCS067)的恩拉霉素高产菌株，其保藏号是CGMCCNo. 6220，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会(CGMCC)，保藏日期是2012年6月14曰。本专利技术所提供的DCS067菌株其微生物学特征如下 单菌落的形态为菌落直径2-3mm，孢子灰色或白色，丰满。显微镜观察孢子圆形或椭圆形。本专利技术提供的DCS067的制备方法，包括以下步骤 a、孢子悬液I的制备取杀真菌链霉菌的出发菌株，接种于斜面培养基上，在28. 0±0. 5°C、相対湿度40%-60%条件下培养5_8天，然后加入无菌水，将孢子刮下，混匀，得到孢子悬液I ; b、有机溶剂处理向孢子悬液I中加入无菌有机溶剂，振荡后静置，分层，取水相得到孢子悬液II ;所述振荡可以采用漩涡振荡器振荡15-60 S，静置时间最好为15-30min。C、紫外诱变将孢子悬液II置于灭菌的培养皿中，于波长为254nm的紫外灯下照射45-60s ;照射吋，最好是在功率为30W的紫外灯下垂直距离30cm处照射。d、抗性筛选将诱变处理后的孢子悬液II涂布在含有抗生素的分离培养基上，在28. 0±0. 5°C、相対湿度40%-60%条件下培养5_8天，生成具有抗生素耐药性的若干单菌落；培养时最好第一天正置，第二天起倒置培养；分别挑取上述单菌落，接种于斜面培养基上，在28. 0±0. 5°C、相対湿度40%-60%条件下培养5_8天后，接种于种子培养基上，在28. 0±0. 5°C, 200^220 rpm条件下培养26_30h后，接种于发酵培养基上，在28. 0±0. 5°C，200^220 rpm条件下培养9-12天，得到发酵液，采用HPLC法测定发酵液中恩拉霉素效价，其中，效价最高的发酵液对应的菌株即为本专利技术所述杀真菌链霉菌(Streptomycesfungicidious) DCS067。本专利技术首先将菌株孢子悬液经过有机溶剂处理，去除了孢子表面的多糖被、蛋白类物质等附着物，有利于后续的诱变和筛选。这是因为菌株细胞在生长繁殖过程中，孢子周围会形成主要由多糖被以及蛋白类物质组成的附着物，此类附着物不仅能阻挡紫外线的作用，还能防碍抗生素的渗入，同时，多糖被中还含有较高浓度的抗生素降解酶，进一歩阻止了抗生素对深层孢子的影响。去除上述附着物，能够使孢子更好地暴露于外部环境中。本专利技术在后续步骤中，采用了紫外诱变和抗生素抗性筛选相结合的方式，克服了以往单ー诱变的不足，进ー步提高了突变菌株的恩拉霉素产率。与出发菌株相比，本专利技术所述菌株的恩拉霉素产率提高了 47. 80%。本专利技术a步骤所述孢子悬液I中孢子浓度最好为IOll-IO13个/mL或者是吸光度A6tltl为I. 0-2.0 ;该浓度或吸光度下的孢子悬液，易于除去孢子表面的附着物(多糖被、蛋白类物质)，同时还具有良好的繁殖性能。本专利技术b步骤所述有机溶剂最好 是经灭菌处理的苯酚、三氯甲烷、正十六烷、正己烷、正辛烷、正十二烷、正辛醇、ニ甲苯中的任意ー种或几种的混合物。其中，更优选的组合是苯酚和三氯甲烷的混合物；混合物中，苯酚和三氯甲烷的体积比最好为25:4。采用上述混合物对孢子悬液I进行处理时，能够更好地除去孢子表面的多糖被、蛋白类物质。按质量体积比计算，本专利技术所述斜面培养基的成分最好为0. 5-1.0%麦芽糖粉，0.05-0. 10%干酵母粉，0. 05-0. 10%金枪鱼膏，0. 06-0. 12%胰蛋白胨，0. 1-0. 5%氯化钠，1.8-2. 2%琼脂，其余为水，所述分离培养中抗生素的含量优选0. ro. 7ug /mL，其余成分及含量与斜面培养基相同，所述斜面培养基和分离培养基均采用质量百分含量为30%的NaOH水溶液调节pH至6.7±0. I。本专利技术所述分离培养基中的抗生素优选链霉素。按质量体积比计算，本专利技术d步骤所述种子培养基成分最好为2.5-4.5%玉米粉，0. 2-0. 8%玉米蛋白粉，0. 2-0. 8%棉籽饼粉，I. 5-2. 5%轻质碳酸钙，0. 15-0. 35%硫酸铵，0.02-0. 05%硫酸亚铁，0. 05-0. 25%磷酸ニ氢钾，I. 5-3. 5%玉米浆，其余为水，该培养基采用质量百分含量为30%的NaOH水溶液调节pH至6. 7±0. I。按质量体积比计算，本专利技术d步骤所述发酵培养基成分最好为6-15%玉米粉，2-6%玉米蛋白粉，0. 2-0. 8%轻质碳酸钙，0. 2-0. 8%氯化钠，0. 1-0. 5%硫酸铵，0. 003-0. 012%硫酸亚铁，0. 007-0. 027%磷酸ニ氢钾，0. 1-0. 5%尿素，0. 005-0. 015%氯化锌，0. 05-0. 25%氢氧化钾，0. 07-0. 15%玉米浆，0. 1-0. 5%L-乳酸，0. 04-0. 12%耐高温a -淀粉酶，其余为水，该培养基采用质量百分含量为30%的NaOH水溶液调节pH至5. 9±0. I。本专利技术所述菌株能够用于恩拉霉素的生产。用于恩拉霉素生产时，最好在28. 0±0. 5°C，20(T220 rpm条件下，将DCS067菌株在发酵培养基中发酵9-12天，制得含有恩拉霉素的发酵液；发酵采用的培养基成分最好为6-15%玉米粉，2-6%玉米蛋白粉，0. 2-0. 8%轻质碳酸钙，0. 2-0. 8%氯化钠，0. 1-0. 5%硫酸铵，0.003-0. 012%硫酸亚铁，0. 007-0. 027%磷酸ニ氢钾，0. 1-0. 5%尿素，0. 005-0. 015%氯化锌，0.05-0. 25% 氢氧化钾，0. 07-0. 015% 玉米浆，0. 1-0. 5%L-乳酸，0. 04-0. 12% 耐高温 a -淀粉酶，其余为水，该培养基采用质量百分含量为30%的NaOH水溶液调节pH至5. 9±0. I。本专利技术所述杀真菌链霉菌DCS067经菌株复试及稳定性考察结果可知，其具有良好的传代稳定性，同时用于生产恩拉霉素时，可有效提高恩拉霉素的产率。本专利技术所述方法其筛选方法，操作简便，结果可靠。具体实施例方式下面用具体实施例来进ー步说明本专利技术的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种恩拉霉素高产菌株，其特征在所述菌株保藏名称是杀真菌链霉菌（Streptomyces？fungicidious）DCS067，保藏单位CGMCC，保藏号是CGMCC？No.6220，保藏日期2012年6月14日。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王雪峰，闫彩洁，刘卫哲，
申请(专利权)人：河北圣雪大成制药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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