本发明专利技术公开一种灵芝酸高产工程菌株kmust-VGB-1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.11301，本发明专利技术提供的灵芝工程菌，是通过选用灵芝强启动子P-gpd表达透明颤菌血红蛋白VGB基因，得到高产灵芝酸灵芝工程菌kmust-VGB-1；通过摇瓶发酵实验表明，该菌在其细胞生长不受影响的情况下，VGB转化子菌株产单体灵芝酸GA-Me，GA-T，GA-Mk，GA-S分别是WT菌株的3.1，3.2，2.1，3.6倍，因此，本高产菌株可以作为生产灵芝酸的工程菌株，具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程和代谢工程领域的，具体设及一种通过基因工程在灵芝中表 达透明颤菌血红蛋白Vitreoscillahemoglobin(VGB)基因的方法，构建了一个灵芝酸 的高产工程菌株。
技术介绍
灵芝（GanoofeiTffiS扣Cioh??)是担子菌纲，多孔菌科，灵芝属真菌。灵芝真菌在我 国有20多种，包括赤芝，黄芝，紫芝，黑芝，薄盖灵芝，树舌等。我国应用灵芝作为药物已有 两千多年的历史。灵芝对于增强人体免疫力，调节血糖，控制血压，辅助肿瘤放化疗，保肝护 肝，促进睡眠等方面均具有显著疗效。由于其特殊的要用价值，灵芝的有效成分分析和药理 学研究已经引起了国际上的广泛关注，尤其在日本，美国，韩国等国家。目前，灵芝的研究已 经深入到了分子水平，一些专著相继出版，从不同的角度介绍了灵芝的生物学特性、栽培技 术、药理学作用及临床应用等情况。灵芝酸是一类分子结构中含有簇基的=祗类物质，从结构来看它属于高度氧化的 羊毛酱烧衍生物。自1982年KubotaT等人首次分离得到灵芝酸W来，目前已有130多种 灵芝酸被分离出来。它们多为四环=祗类化合物，含有30个碳原子，结构中一般都有径基， 在IR中有较强的径基吸收峰。在紫外光谱中也呈现多个波长的特征吸收，多数是在250 nm、237nm、365nm处有吸收峰。灵芝酸具有许多重要的药理活性如：抗癌，灵芝酸类物质 能明显抑制小鼠肝肉瘤（HTC)细胞的增殖；护肝，灵芝中的灵芝酸提取物能加强其解毒 作用；抗HIV;降血压；抗氧化；抑制血小板凝集，抑制组胺释放，镇痛，抑制真核细胞DNA多 聚酶活性，抑制法尼基蛋白转移酶活性和促进体液免疫功能等作用。 透明颤菌血红蛋白（vitreoscillahemoglobin,VGB)是20世纪70年代后期 发现的一种血红蛋白，该蛋白质能使透明颤菌在低氧的环境下生存，并保持较高的生长速 率。透明颤菌为专性好氧的革兰氏阴性菌，为贝日阿托氏菌属度eggiatoa)，能在贫氧条 件下合成一种可溶性的血红蛋白W满足其对氧的需求。自从VGB在大肠杆菌中成功地进行 表达W来，VGB已在假单胞杆菌、链霉菌、霉菌和酵母等多种生物体内实现克隆，它已越来越 多地应用到微生物发酵工业的许多领域，并取得了显著成果。将表达透明颤菌血红蛋白（ vitreoscill址emoglobin,VGB)的基因VGB，转化到灵芝基因组上，实现灵芝细胞内表达透 明颤菌血红蛋白，促进灵芝细胞对氧气的利用能力。在限氧条件下，外源表达透明颤菌血红 蛋白可W明显促进宿主细胞生长和蛋白的合成，同时VGB的表达可W促进氧的扩散，改善 宿主的好氧代谢途径。 灵芝酸合成途径首先是由乙酷辅酶A(AcetylCoA)在硫解酶（Acetoacet^ CoAthiolase)催化下缩合形成乙酷乙酷辅酶A(Acetoace切1CoA)，乙酷乙酷辅酶A 经HMG-CoA合成酶（HMG-CoAsynthase)催化与另一分子乙酷CoA缩合生成3-径基-3 甲基-戊二酸单酷辅酶A(HMG-CoA)，然后HMG-CoA还原酶（HMG-CoAreductase,HMGR )催化HMG-CoA转化为甲径戊酸。甲径戊酸经甲径戊酸激酶（MVK)、甲径戊酸5-憐酸激 酶（PMK)和MDDS步酶促反应转化为IPP。IPP进一步转化成法呢醋焦憐酸FPP。FPP在 整締合酶squalenesynthase(SQS)的催化下合成整締SQS后经过整締单加氧酶的作 用产生整締2，3-氧化物，再经过羊毛酱醇合酶（LS)的作用产生羊毛酱醇。羊毛酱醇 又经过一系列氧化还原反应生成灵芝酸，而VGB基因的表达促进灵芝细胞对氧气的利用能 力，增强了羊毛酱醇到灵芝酸通路的氧化还原反应，提高了灵芝酸的合成。灵芝酸的合成途 径如下所示： 随着人们生活水平的提高，各种疾病的发生率也逐年递增。于是，人们对健康的关 注也越来越来广泛。灵芝作为一种良好的中药对提高人体免疫力，抗氧化等方面具有重要 的地位，尤其是在治疗癌症方面表现尤为突出。 由于野生灵芝生长周期长，受环境因素影响大且野生灵芝资源有限，灵芝菌丝培 养成为生产活性物质的重要方法。随着对灵芝活性物质需求的不断增加，如何提高灵芝的 产量和增加灵芝的有效成分越来越引起人们的关注。液体深层发酵技术是进行快速工业化 生产的重要手段。现在市售的灵芝酸主要是从灵芝子实体和液体深层发酵得到的菌丝体中 获得。由于野生灵芝液体深层发酵时灵芝酸在灵芝细胞中的含量较低，分离纯化也较难，限 制了灵芝酸的活性及作用机理研究及其广泛应用。近年来，基因工程与代谢工程迅速发展， 成为了现代分子育种的重要手段。通过分子克隆和基因拼接等分子生物学方法来改造菌株 的基因组，从而提高活性成分的含量越来越受学者们的青睐。如何从分子水平上提高灵芝 酸的产量是目前急需解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决野生型灵芝菌株自身产灵芝酸较低的问题，提供一种灵芝酸 高产菌株，该菌株为高产灵芝酸的灵芝（GanoofeiTffiS扣Ci沁曲）工程菌kmust-VGB-1，已于 2015年9月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，地址：北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO. 11301。 本专利技术灵芝酸高产工程菌株的构建方法如下： WPMD19-T为起始载体并使用灵芝本身的强启动子P-卻式终止子T-so%《、cAx基因，cAx基因（具有carboxin抗性）是来自灵芝本身的抗性基因，其特点是在磨茹类担子菌 的转化体系中同源标记基因的转化效率更高，能够稳定遗传，抗性强。 1、将灵芝启动子P-巧W与终止子T- 50%《与PMD19-T连接，将灵芝cAx抗性基因插 入到I酶切位点，从而构建成PJW-EXP载体；其具有灵芝的强启动子和终止子，并具有 灵芝本身的抗性； 其中扩增灵芝强启动子P-巧>端]引物序列为：扩增灵芝5诚^^因终止子的引物序列为：扩增灵芝cAx抗性基因的引物为：2、W美国芝加哥IIT中屯、Illinois技术研究所B.C.Stark教授提供的质粒PUC8:16 为模板，克隆了透明颤菌血红蛋白的基因（所用的引物为VGB-Nhe-F和VGB-Sma-R)，并插 入到pJW-EXP载体中，得到pJW-EXP-tVGB载体；引物序列为：3、 通过PEG介导原生质体融合的方法，将pJW-EXP-tVGB转化到野生型灵芝细胞中，W carboxin作为抗性来筛选灵芝转化子，在含有carboxin抗性的CYM平板上筛选出转化子； 4、 将转化子在carboxin抗性的CYM平板中进行传代培养； 5、 灵芝细胞的液体培养： PDA培养基（g/L):葡萄糖10,琼脂20，硫酸儀1.5，憐酸二氨钟3,维生素Bl0. 05和制备好的±豆汁； ±豆汁的制备方法：将200g去皮新鲜±豆切成小块，加入去离子水1. 0L煮沸30min,用八层纱布过滤，取滤液，用于PDA培养基的配制； 种子培养基（g/L):葡萄糖35,蛋白腺5,酵母膏2.5,憐酸二氨钟1，硫酸儀0.5和维 生素Bl0.05。 发酵培养基（g/L):蛋白腺5、酵母膏5、憐酸二氨钟1.0、硫酸儀0.5、维本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种灵芝酸高产工程菌株kmust‑VGB‑1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.11301。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐军伟，张德怀，李焕军，韩李梁，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南;53
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。