分泌表达抗菌肽Metchnikowin大肠杆菌基因工程菌的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种构建上述分泌表达抗菌肽Metchnikowin大肠杆菌基因工程菌的方法，包括将抗菌肽Metchnikowin基因连接，构建重组pET-22b质粒，转化大肠杆菌BL21感受态细胞。本发明专利技术的有益效果在于，高效稳定的分泌表达，下游DP水解位点使得切割蛋白成本低，更安全。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种。
技术介绍
抗菌肽是在诱导条件下，生物体免疫防卫系统产生的小分子活性肽类，广泛分布于植物，动物以及人类。抗菌肽是由基因编码、由核糖体合成的。目前已经发现、鉴定的抗菌肽已超过千种，大多带净正电荷。从结构上看可以分为α-螺旋型、折叠型、富含二硫键的、富含脯氨酸等多种类型。抗菌肽抑菌谱广，有些抗菌肽还可以特异性地抑制某些肿瘤细胞的生长。抗菌肽可以用于医药卫生、食品添加剂、饲料添加剂等方面。抗菌肽与传统抗生素抑菌机理不同，抗菌肽的作用方式主要是选择性地攻击病原物的细胞膜，相应地病原物不易产生针对抗菌肽的耐药性，因此使用抗菌肽可以解决细菌耐药性问题。同时又由于它是一种肽，可以被消化道消化、吸收对人体无害，无残留，因此，抗菌肽在医药、畜牧业、农业等方面都有十分广泛的应用前景。抗菌肽在生物体内含量极低，生产成本居高不下，严重影响其广泛应用；研究开发其大规模生产方法具有十分积极的意义。目前，生产抗菌肽的方法主要有三种:1.直接从生物体中提取天然抗菌肽:抗菌肽广泛存在于低等到高等动物的特定组织中，但是含量非常少，且提取工艺复杂，成本昂贵，难以满足大规模生产的要求；2.化学方法合成抗菌肽:化学合成法成本高，同时难以保证合成肽类的天然结构和生物活性；3基因工程方法:采用该方法是如今研究的热点，也是获得抗菌肽的有效途径之一。Metchnikowin是一种富含脯氨酸的小肽。含脯氨酸抗菌肽的作用机制，一般认为是直接穿过细菌细胞膜，进入细胞后与细胞内的生物大分子例如核酸分子相互作用，从而达到杀菌抑菌的效果。大多 数此类含脯氨酸抗菌肽主要针对革兰氏阴性菌，但来源于果蝇的Metchnikowin却主要针对革兰氏阳性菌以及真菌起作用。由于在体内，不同结构特点的抗菌肽是相互配合发挥作用的，因此相应地需要在体外对不同抗菌肽进行研究。目前对于含脯氨酸抗菌肽的重组表达报道不多，Metchnikowin的重组表达也未见报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种。本专利技术是通过以下技术方案来实现的。一种构建上述分泌表达抗菌肽Metchnikowin大肠杆菌基因工程菌的方法，包括将抗菌肽Metchnikowin基因和融合基因连接，构建重组pET_22b质粒，转化大肠杆菌BL21感受态细胞。进一步地，上述抗菌肽Metchnikowin基因含有核苷酸序列SEQ ID:N0 1、SEQ ID:N02，含有氨基酸序列 SEQ ID N03:SEQ ID N04。进一步地，上述抗菌肽Metchnikowin基因是通过扩增获得的，以含有Metchnikowin基因序列的质粒为模板,在其下游设计EcoRI酶切位点,其引物为:MF: 5 ’ -CATCGTCATCAGGGTCCG-3，;MR: 5，-GGAATTCTTAATAAATCGG -3，。进一步地，上述融 合基因的扩增，以含有融合蛋白基因的质粒为模板，在序列上游设计Nco I酶切位点，其引物:CF:5，-CATGCCATGGATCACCATCATCATCAT-3，;CR: 5’-AAGGGTTTCCGAAGGCTTGG-3’。进一步地，上述构建重组pET_22b质粒中，以上述扩增的融合蛋白基因与上述扩增的抗菌肽Metchnikowin基因磷酸化后用T4DNA连接酶连接。进一步地，上述诱导表达:振荡培养基因工程菌至对数期，加入诱导剂诱导24小时，培养温度:25°C。本专利技术的有益效果:高效稳定的分泌表达，下游DP水解位点使得切割蛋白成本低，更安全。附图说明图1为本专利技术的电泳结果示意图；图2为本专利技术的活性示意图。具体实施例方式下面根据附图和实施例对本专利技术作进一步详细说明。1、基因扩增:(1) Metchnikowin基因的扩增:以含有Metchnikowin基因序列的质粒为模板，在其下游设计EcoRI酶切位点，引物MF:5’ -CATCGTCATCAGGGTCCG-3，; MR:5’-GGAATTCTTAATAAATCGG _3’，反应条件:94°C 45s, 50°C 45s, 72°C 30s，30 个循环，72°CIOmin0反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒回收。(2)融合蛋白基因的扩增:以含有融合蛋白基因的质粒为模板，在序列上游设计 Nco I 酶切位点，引物:CF:5’ -CATGCCATGGATCACCATCATCATCAT-3，，CR::5’ -AAGGGTTTCCGAAGGCTTGG-3’。反应条件:94°C45s, 50°C 45s，72°C 30s，30 个循环，72°C IOmin0 反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,凝胶回收试剂盒回收。(3) Metchnikowin基因和融合蛋白的链接:将Metchnikowin基因PCR产物和融合蛋白基因PCR产物按1:1混合，用T4PNK进行磷酸化后用T4DNA连接酶连接。再使用(I)和(2)中的引物MetchnikowinF和引物CR进行PCR扩增，反应条件:94°C 45s, 50°C 45s, 72°C 30s，30个循环，72°C IOmin0反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒回收。2、克隆转化:PCR产物和载体均用EcoRI和NcoI酶切，产物经纯化后用T4DNA连接酶连接得到重组质粒1:pET-22b- MetchnikowinC,转化BL21 (DE3)感受态细胞,氨节青霉素筛选阳性克隆，少量提取质粒，并测序。3、诱导表达:将含有重组质粒I的工程菌接种至含有50ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中37°C过夜振荡培养，按1%量接入新鲜的LB培养基，37°C振荡培养至0D600 ^ 0.5时,加入终浓度lmmol/L的IPTG,25°C诱导24h, 9000r/min离心lmin,收集上清液。4、化学切割和纯化取20ml上清液，缓慢滴加50%的乙酸溶液直至溶液pH=2.5。密闭容器，至于50摄氏度水浴内恒温72小时，12000 r/min离心lOmin，得到含Metchnikowin上清液，采用阳离子交换层析，纯化Metchnikowin。上述实施例只为说明本专利技术的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本
技术实现思路
并加以实施，并不能以此限制本专利技术的保护范围。凡根据本专利技术精神实质所作的等效变化或 修饰，都应涵盖在本专利技术的保护范围内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建所述分泌表达抗菌肽Metchnikowin大肠杆菌基因工程菌的方法，其特征在于，包括将抗菌肽Metchnikowin基因连接，构建重组pET?22b质粒，转化大肠杆菌BL21感受态细胞。

【技术特征摘要】
1.一种构建所述分泌表达抗菌肽Metchnikowin大肠杆菌基因工程菌的方法,其特征在于，包括将抗菌肽Metchnikowin基因连接，构建重组pET_22b质粒，转化大肠杆菌BL21感受态细胞。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述抗菌肽Metchnikowin基因含有核苷酸序列 SEQ ID:N0 1、SEQ ID:N02，含有氨基酸序列 SEQ ID N03:SEQ ID N04。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述抗菌肽Metchnikowin基因是通过扩增获得的，以含有Metchnikowin基因序列的质粒为模板,在其下游设计EcoRI酶切位点，其引物为:MF:5’ -CATCGTCATCAGGGTCCG-3’ ;MR:5，...

【专利技术属性】
技术研发人员：查向东，恽辉，余忠丽，程林春，赵大伟，耿玉静，
申请(专利权)人：安徽希普生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：