本发明专利技术涉及翻译后修饰的异源性蛋白的细菌细胞表面展示。提供了分离的编码蛋白质物质的核酸构建体，所述蛋白质物质从N端至C端包含至少(a)N端羊毛硫抗生素前导序列；(b)将被翻译后修饰成含脱氢残基或硫醚桥的多肽的感兴趣的氨基酸序列；(c)亲水跨细胞壁结构域；(d)分选酶识别基序；(e)疏水跨膜结构域；和(f)C端带电荷的膜锚定结构域。还提供了表达所述构建体的革兰氏阳性宿主细胞及宿主细胞的文库。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及蛋白质工程和筛选治疗性相关肽的领域。更具体地，涉及翻译后修饰的异源性蛋白质的细胞表面展示。在微生物(例如细菌)表面的蛋白质或肽的异源展示是有用的研究手段，并已经与宽范围的有趣的应用相关联。将蛋白质或肽功能与编码的基因相连接能够从大的组合的文库中筛选和/或最优化具有期望性质的肽。已经开发了多种展示形式，包括核糖体展示、噬菌体展示、细菌表面展示和酵母展示。噬菌体展示或许是最为熟知的系统。
技术介绍
细胞表面展示的一个最有趣的应用是从大文库中选择对感兴趣的治疗性的靶分子高亲合的配体。迄今，只展示过线性肽、二硫键连接的环肽和与有机核耦合的肽。这导致了多种有用的肽的鉴定，包括治疗有效性(前导)肽。然而，已经认识到这些肽对蛋白质水解的敏感性和不稳定性为其治疗应用的主要缺点。转译后向肽中引入环状结构，例如硫醚交联，可避免这些稳定性问题。然而，目前，仍然难于有效地将这样的结构引入到合成肽中，尤其是大的肽中。
技术实现思路
本专利技术旨在提供允许脱氢氨基酸和或含硫醚肽的细胞表面展示的新型展示系统。为此，构建了独特的重组核酸构建体，其编码融合肽，所述融合肽除了包含将被环化的肽序列外，还包含特异性功能元件的组合。惊奇地发现环状结构易于被表达所述构建体并包含用于抗生素的生物合成和输出的装置的宿主细胞，例如乳酸菌(Lactococcus lactis)的表面制造或展示。更具体地，本专利技术提供了编码融合肽的分离的核酸序列，所述融合肽从N端到C端至少包含如下元件:(a) N端羊毛硫抗生素前导序列(b)将被翻译后修饰成含脱氢残基或硫醚的多肽的感兴趣的氨基酸序列(c)亲水跨细胞壁结构域(d)分选酶识别基序(e)疏水跨膜结构域(f)C端带电荷的膜锚定结构域。本专利技术的其它方面涉及包括所述分离的核酸的表达载体、包括所述表达载体的宿主细胞和包括多个宿主细胞的宿主细胞文库。本专利技术还可应用于生产表达含脱氢残基的肽的宿主细胞(的文库)。所述特异性核酸构建体允许开发同时用于编码的肽的转译后酶修饰及修饰的(环化)肽的展示的细菌宿主细胞。本领域中已知的其它展示系统如噬菌体展示理论上可适于表达和展示可被化学手段环化 的肽，例如二硫桥肽的碱辅助脱硫(Galande等，2003Biopolymers71，534-551)。然而，观察到碱性环境严重地减小了噬菌体的存活率和感染性。相反，本专利技术允许使用高度有活力的革兰氏阳性宿主细胞，尤其是乳酸菌，所述宿主细胞可例如在筛选期间抵抗严酷环境。此外，通过化学手段的环封闭不是立体和区域特异的；具有形成二硫键桥的两个L-Cys残基的特定的肽将产生3种非对映的含羊毛硫氨酸的肽的混合物，羊毛硫氨酸的的构型为LL、LD和DL。相反，羊毛硫氨酸酶装置只产生DL-立体异构体，并且在多个环的情况下，只有一个环模式。此外，不需要进行具有不确定的产率的使成本上升的反应步骤；修饰和展示全部为细菌系统所固有。再进一步，(乳酸)细菌的尺寸足够大以使用FACS分析来筛选。已经说明羊毛硫抗生素合成酶在膜结合复合物中被组织(Siegers等，1996.J.Biol.Chem.271，12294-12301 ；Kiesau 等，1997.J.Bacteriol.179，1475-1481 ；Sahl 等1998.Annu.Rev.Microbiol.52:41-7)。这个复合物由羊毛硫抗生素转运体(LanT)、脱水酶(dehydrating enzyme) (LanB,也称为脱水酶(dehydratase))和环化酶(LanC)组成。在一些羊毛硫抗生素的情况中，由双官能酶(LanM)进行脱水和环化步骤。在核糖体中合成的前多肽原的N端羊毛硫抗生素的前导序列为羊毛硫抗生素酶的识别序列，开始于脱水酶或同时进行脱水和环化的酶。认为所述前导序列结合到所述羊毛硫抗生素复合体上以使所述前多肽原接近所述羊毛硫抗生素酶。所述酶复合体暗示所述脱水和环化酶需要附着到转运体上，否则羊毛硫抗生素前多肽原将不经修饰被输出，或者修饰的肽将在细胞内聚集。在多数情况下，羊毛硫抗生素的转运完全依赖于专用的羊毛硫抗生素转运体。显示乳链菌肽转运体(NisT)的破坏引起完全修饰的乳链菌肽前体在细胞内的积累(Qiao等1996.FEMS Microbiol.Lett.144，89-93)。Kuipers等以前证明羊毛硫抗生素转运体NisT可分泌未修饰的羊毛硫抗生素和前导肽与非羊毛硫抗生素肽的融合体，并且在无环化酶的情况下，脱水酶和羊毛硫抗生素转运体的结合也是功能性的(2004.J.Biol.Chem.279，22176-22182)。上述六个不同的元件在单个融合蛋白中的具体组合和相对顺序在现有技术中未知或不可从现有技术中推导出来。申请人:名下的W02006/062398公开了几种羊毛硫抗生素前导肽及它们的应用，例如在融合蛋白中生 产将被脱水酶转译后脱水的感兴趣的肽。根据W02006/062398，所述前导肽和将被修饰的肽前面有非羊毛硫抗生素输出信号，例如SEC输出信号。所述输出信号和前导肽可被细胞锚定序列分离，例如LPTX-分选酶识别基序。W02006/062398没有公开元件(c)、(e)和(f)。Moll 等，Antonie van Leeuwenhoe Vol.97, N0.4, 2010, 319 333 页为非羊毛硫抗生素肽中脱氢氨基酸和羊毛硫氨酸的微生物工程的综述。通常教导肽中羊毛硫氨酸的微生物工程可允许产生独特文库和伴随的展示系统。没有提及如何技术上获得这样含羊毛硫氨酸的肽的文库，更没有提出本专利技术的涉及展示具有转译后引入的环状结构的肽的独特的方法。相反，本领域技术人员将选择更常规的方法，例如含二硫键的肽的噬菌体展示，然后化学环闭合。Rink 等(2010) J.0f Pharmac.And Toxic.Methods, Vol.61, N0.2, 210 218 页涉及通过D氨基酸和环化来稳定多肽药物。将感兴趣的肽直接或通过间隔子遗传地融合到羊毛硫抗生素前导肽上。未提及转译后环化的肽的细胞表面展示。Leenhouts 等(1999) Antonie van Leeuwenhoe, Vol.76, N0.1-4, 367 376 页公开了几种将蛋白质锚定到细胞壁的方法，包括LPXTG锚定基序。还教导带电荷的尾部和疏水结构域可作用为定位所述用于蛋白质裂解的靶定基序的临时终止子。如在W02006/062398中，结合所述Sec信号序列和SEC介导的输出讨论了所述元件。Leenhouts未提及任何革巴定基序与将被所述羊毛硫抗生素装置识别的元件的组合。任何类型的羊毛硫抗生素前导序列可被用于实践本专利技术，只要其可被至少一种羊毛硫抗生素脱水酶识别，还优选可被可形成羊毛硫氨酸桥的环化酶识别。在一个实施方式中，本专利技术的多肽中的前导肽具有羊毛硫抗生素前导共有基序，所述前导共有基序可源自已知羊毛硫抗生素前导肽的氨基酸序列比对。羊毛硫抗生素前导肽的氨基酸序列可从公共文库获得。例如，申请人名下的W02006/062398的表IA和表IB展示了羊毛硫抗生素前导肽的示例性比对。本领域技术人员能够从比对的序列得到共有基序，例如用公共或商购的比对软件，例如Vector NTI的AlignX。Ali本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.07.06 EP 10168589.91.一种编码融合肽的分离的核酸构建体，所述融合肽从N端到C端至少包含以下序列元件: (a)N端羊毛硫抗生素前导序列； (b)将被翻译后修饰成含脱氢残基或硫醚桥的多肽的感兴趣的氨基酸序列； (C)亲水跨细胞壁结构域； (d)分选酶识别基序； (e)疏水跨I吴结构域；和 (f)C端带电荷的膜锚定结构域。2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中，所述羊毛硫抗生素前导序列为乳链菌肽前导序列。3.根据权利要求1或2所述的核酸构建体，其中，所述跨细胞壁结构域衍生自乳酸菌的多域细胞膜蛋白酶的跨细胞壁结构域。4.根据权利要求3所述的核酸构建体，其中，所述跨细胞壁结构域包含瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)的 prtH、乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)的 prtP、化胺性链球菌(Streptococcus pyogenes)的 scpA或无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的csp的跨细胞壁结构域的氨基酸序列或它们的功能类似物或片段。5.根据前述任一项权利要求所述的核酸构建体，其中，所述分选酶识别基序包含氨基酸序列LPXTG，其中X可为氨基酸D、E、A、N、Q或K，优选地，其中所述分选酶识别基序由LPKTG组成。6.根据前述任一项权利要求所述的核酸构建体，其中，所述疏水跨膜结构域具有20至30个氨基酸的长度。7.根据前述任一项权利要求所述的核酸构建体，其中，所述带电荷的膜锚定结构域具有至少四个氨基酸残基的长度，优选地，其中，至少50%的所述残基为带正电荷氨基酸，更优选赖氨酸和/或精氨酸残基。8.根据前述任一项权利要求所述的核酸构建体，其中，所述蛋白质物质在元件(a)和(b)之间和/或元件(b)和(c)之间进一步包含至少一个蛋白水解裂解位点。9.根据权利要求8所述的核酸构建体，在元件(a)和(b)之间包含因子Xa蛋白酶识别位点，优选氨基酸序列IEGR。10.根据权利要求8或9所述的核酸构建体，在元件(b)和(c)之间包含人鼻病毒3C蛋白酶识别位点，优选氨基酸序列EALFQGP。11.根据前述任一项 权利要求所述的核酸构建体，其中，所述感兴趣的氨基酸序列为治疗相关的肽，优选地选自由激素、酶抑制剂、酶活化剂、受体配体、抑制肽、羊毛硫抗生素蛋白和病毒蛋白组成的组中。12.—种表达载体，包含根据权利要求1至11的任一项所述的核酸。13.—种革兰氏阳...
【专利技术属性】
技术研发人员：芝贝·博斯姆，
申请(专利权)人：兰提欧派普有限公司，
类型：
国别省市：
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