本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种对鳞翅目有毒的人工合成的苏云金芽孢杆菌杀虫基因，该人工合成的基因包含Vip83Cry9Ca*基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列。包含该基因质粒的大肠杆菌(Escherichia?coli)DH5α/Bt./6p/pGEVC9C保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC?NO：M2011363。经过生物学实验验证，证明该杀虫融合基因对鳞翅目具有毒性，可专一性毒杀小菜蛾等农业害虫。本发明专利技术公开了上述融合蛋白在转基因杀虫微生物方面的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物基因工程领域，具体涉及一种人工合成的对鳞翅目有高毒力的Bt双价融合蛋白及其编码基因，该基因包括Vip83*和Cry9Ca*基因及其所述的构成和编码序列。
技术介绍
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)是口前最常用的商品化杀虫微生物，其表达杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystal proteins),营养期杀虫蛋白(Vegetativeinsecticidal proteins),对鳞翅目等农业上常见害虫具有专一'丨生毒杀作用(喻子牛etal.，1996) ο目前，在生产应用中使用最多的是杀虫晶体蛋白(ICPs)，ICPs主要分为俩大类，Cry类蛋白和Cyt类蛋白，截止2009年6月6日，克隆得到的ICPs基因已增至58群449中Cry类基因，2群27种Cyt基因(Crickmoreet al., 1998)。其晶体结构与功能以及杀虫机制已有了一定的了解(Li et al.,1991)。Cry类蛋白又称为δ内毒素，在序列结构上分为明显的N-半段跟C-半段，其中C-半段富含二硫键，而N-半段为核心毒性区，在空间结构上有分为3个结构域(Schn印f etal.，1998)。Domain I 6个亲水的α螺旋围绕一个疏水的α 5螺旋，Domain II三个反平行β 折叠片.Domain III 两个反平行 β 折叠片形成 β-sandwich (Galitsky et al..2001)。Cry类蛋白在进入敏感昆虫的中肠之后，在碱性环境下水解，切掉C-半段和N-段的几个氨基酸残基，活化成具有活性的δ内毒素，然后Domain II上各突起与敏感昆虫中肠上皮细胞的受体钙粘蛋白(Cadherin-like Protein)结合，形成毒素寡聚体，然后再与第二受体糖基磷酰肌糖锚定氨基多肽酶(GP1-APN)或者糖基磷酰肌糖锚定碱性磷酸酶(GP1-ALP)结合(Bravo et al. , 2004),诱使毒素构象发生变化,Domain I中疏水的α 5螺旋伸出插入到昆虫中场上皮细胞的细胞膜，形成膜离子通道，进而引起细胞渗透平衡被破坏，细胞吸胀破裂，最后导致肠壁破裂，昆虫死亡(Bravo et al., 2004)。一般认为Domain III起到防止毒素被蛋白酶降解的作用，并参与到一部分受体的识别过程(Li et al.，1991)。自1996年转基因作物实现商业化以来，全球转基因作物种植面积每年均以两位数的百分率迅速增长。继2006年突破了 I亿公顷后，2007年全球转基因作物种植面积已达1.143亿公顷，较1996年增长了 67倍(张锐et al.，2007)。转基因作物育种已成为最富活力的农业技术，不仅创造了可观的经济、社会和生态效益，而且显示出对于未来解决环境、能源等重大问题的巨大潜力。目前，应用在发酵生物农药和转基因植物的主要为Cry类蛋白，但由于现在使用的Bt.杀虫基因存在着种类单一，害虫抗性增加迅速的问题。大多数为Bt.δ-内毒素晶体毒蛋白的CrylAc，少部分为嵌合的CrylAb ;另外许多准备释放的转抗虫基因玉米和水稻大多数也是这两种基因。这种单一的抗虫基因推广给各种抗虫作物种植的抗虫性保持存在较大的风险，会缩短害虫对这两种基因产生抗性的时间。经实验证实，CrylAc在棉铃虫中肠上皮细胞结合区位于钙粘蛋白Cadherin第1217-1461位于245个氨基酸残基组成的肽链上。这个区域的缺失或者突变可能导致棉铃虫抗性的急剧增加(Peng et al.,2010) 因此，开发新型杀虫蛋自，或者将不存在交叉抗性的几种杀虫蛋白构建成融合基因，可以减缓害虫抗性产生的速率，这已经成为当前转基因研究的热点。营养期杀虫蛋白Vip3A被誉为第二代杀虫蛋白，与杀虫晶体蛋白ICPs不同，Vip3A苏云金芽孢杆菌营养生长期所产生的蛋白，对鳞翅目昆虫具有很独特的杀虫活性，尤其对ICPs有抗性的小地老虎的毒性比CrylAc高260倍，对鞘翅目无效。它不同于Bt芽孢期产生的晶体毒蛋白ICPs，其晶体结构，敏感昆虫肠道受体，杀虫作用机理尚不明确(Estruchet al.，1996)。Vip3A在昆虫肠道内被水解为四种主要蛋白产物，其中33KD的蛋白水解产物为Vip3A蛋白的毒性核心结构。Vip3A毒蛋白只要在pH5.0-10.0时均可溶解，其C-末端也不被切除，与敏感昆虫上皮细胞结合，诱发昆虫细胞凋亡，细胞核溶解，最终昆虫死亡。这个可能的毒性机制不能排除 孔形成机制(Yu et al.，1997)。与晶体毒素相比较，营养期杀虫蛋白的研究还刚刚起步不久。Estruch已经成功地将Vip3Aa基因与不同的启动子(如PEPC，Ubi和MTL等)构成表达质粒通过粒子轰击法导入玉米愈伤组织，得到的转基因玉米，对小地老虎和草地贪夜蛾的杀虫效果都很好。peng等评价了转BtVip3A基因的安全性，急性和亚急性的毒理学研究未发现负面的作用，证明利用Vip3A进行生物害虫防治是安全的(Peng et al.，2007)。相信在未来的时间里，营养期杀虫蛋白在延缓害虫对Bt毒素抗性进化上将发挥重要作用。Vip83基因是本申请人所在的农业微生物国家重点实验室从苏云金芽孢杆菌YBT-833中克隆得到的，这个基因与Vip3A存在两个氨基酸的差异(即Gln284 — Lys284，Pro804 — Ser8tl4)，属于Vip3A家族，对小菜蛾，棉铃虫，甜菜夜蛾等鳞翅目具有毒力(蔡启良et al.，2002)。Vip3A与ICP两种毒蛋白在昆虫中肠作用机制不同，二者对昆虫不产生交叉抗性，因此将两种杀虫蛋白同时喂食害虫可以减缓其产生抗性的速率，目前将Vip3A和Cry9Ca作融合表达未见先例。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，针对目前转基因Bt.杀虫蛋白资源存在的不足，本专利技术合成了一种能够提高杀虫毒力和减缓害虫抗性的抗虫融合基因，该基因根据陆地棉偏爱性密码子优化后的基因序列(其核苷酸序列和编码的氨基酸序列见序列表SEQ ID NO:1所示，其蛋白质的序列见SEQ ID NO:2所示)，本专利技术涉及该基因编码的融合蛋白以及该融合蛋白的用途。本专利技术以申请人所在的农业微生物国家重点实验室保存的Vip83基因(参见:Genebank登录号AY044227)和Cry9Ca基因的氨基酸序列(参见:Genebank登录号AX100534)为蓝本，根据陆地棉偏爱的密码子，优化后人工合成了二个Bt.杀虫基因，申请人将该两个基因分别命名为Vip83*和Cry9Ca*。其中，Cry9Ca*只包括有活性的N-半段δ内毒素。申请人将上述得到的Vip83*和Cry9Ca*进行融合后得到如序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列以及SEQ ID NO:2所示蛋白质的序列。本专利技术通过以下技术方案来实现目的:申请人:提供了一段杀虫融合基因，该基因包括从5’ _3’，依次含有编码Vip83*毒素的核苷酸序列和编码或切除了 C半段的Cry9Ca*的核苷酸序列；且上述两个蛋白的核苷酸序列使用同一个开放阅读框内，中间用一段肠激酶序列(EK site)分开。该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，序列全本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人工合成的融合杀虫基因，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所述。
【技术特征摘要】
1.一种人工合成的融合杀虫基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所述。2.一种融合杀虫蛋白，其蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO:2所述，其分子量为159.433.40kDa。3.—种表达苏云金芽胞杆菌杀虫融合蛋白的大肠杆菌(Escherichia coli)DH5 α /Bt./6p/pGEVC9C，保藏在中...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘子铎，董方，林拥军，史瑞平，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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