本发明专利技术公开了一种溶珊瑚弧菌多重毒力因子GeXP快速检测试剂盒和检测方法。本发明专利技术针对已知20个溶珊瑚弧菌(Vibrio?coralliiluyitcus)的毒力基因，设计特异性引物，利用本发明专利技术的检测试剂盒，按照本发明专利技术的方法，可以通过单管反应，一次性快速、高效的同时检测20种基因，而得知检测出样品或环境中是否含有携带这些毒力相关基因、具有潜在致病能力的溶珊瑚弧菌(Vibrio?coralliilyticus)，其检测覆盖面广，可大大提高溶珊瑚弧菌(Vibrio?coralliilyticus)致病性评价的准确性，为溶珊瑚弧菌(Vibrio?coralliilyticus)致病性评价提供了更为有效的检测手段，在对珊瑚虫白化病害的监测、防治方面具有重大的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种专用于可导致珊瑚发生白化现象的病原弧菌一溶珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)的快速检测试剂盒和检测方法。
技术介绍
溶珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)是一种嗜盐性革兰阴性菌,属于弧菌科弧菌属，不能产生孢子的杆状细菌，因具有单根鞭毛而具有运动性，在海洋琼脂上菌落呈现奶油色，在TCBS培养基上显黄色，菌落边缘整齐光滑，最适生长温度为30摄氏度 ，最早从印度洋的白化珊瑚Pocillopora damicornis被分离到,后来在太平洋和红海地区的白化珊瑚中也陆续被分离到，同时在北大西洋牡蛎的幼体中也有发现。近30年来，频繁爆发的各种珊瑚疾病是造成珊瑚退化的重要原因之一，其中白化病害因为具有强烈的传染性而对珊瑚的危害最为严重。在最初，研究者都认为珊瑚白化是由于外部环境变化引起，随着研究的不断深入，最后发现白化作为一种病害，是病原弧菌感染导致。其中溶珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)便是典型可以导致珊瑚发生白化现象的病原细菌。当水温高于26摄氏度时，该弧菌可以表达毒力因子感染珊瑚宿主、抑制与珊瑚共生的虫黄藻的光合作用，而使珊瑚发生白化现象。目前检测病原微生物的方法很多，既有传统的分离鉴定的方法，也有免疫学的方法，但采用最多的还是分子生物学的方法，其主要依赖于PCR技术对某些特异性的基因进行扩增。可是这些方法都存在一定的缺陷(1)检测耗时，过程繁琐；(2)检测灵敏度低，检测出病原菌时往往是发病晚期；(3)检测的目标基因过于单一，容易漏检，由于环境差异导致的同种不同菌株，不能全面反应该种病原菌的潜在致病性。因此，在做病原细菌的检测时，只有同时检测尽可能多的特异基因，才能使检测结果更加具有可靠性，对病原细菌的鉴定更加准确。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种更为快速准确地评价溶珊瑚弧菌(Vibriocoralliilyticus)致病性的溶珊瑚弧菌多重毒力因子GeXP快速检测试剂盒。本专利技术的溶珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)多重毒力因子GeXP快速检测试剂盒，包括PCR反应试剂，多基因PCR引物和GeXP多重扩增反应试剂，其特征在于，所述的多基因PCR引物包括20对溶珊瑚弧菌多重毒力相关因子的PCR引物和一对通用引物，具体为含有荧光标记的通用引物对序列，可按常规技术将荧光标记加到下述通用引物序列上，所述的荧光标记优选为CY5荧光标记，位于通用引物对序列的5’端TY-F: 5，-AGGTGACACTATAGAATA-3，TY-B: 5，-GTACGACTCACTATAGGGA-3，为毒力相关基因flhA(GenBank:NZ_ACZN01000015)设计的引物，扩增的片段大小约为147bp flhA-F AGGTGACACTATAGAATATCCATATCAGGGCGAATCTCflhA-R GTACGACTCACTATAGGGACTTATTCCTGCGGTCCACAT为毒力相关基因TonB(GenBank:NZ_ACZN01000007)设计的引物，扩增的片段大小约为154bp TonB-F AGGTGACACTATAGAATACTCCTCAATCACAGCGTTCATonB-R GTACGACTCACTATAGGGAGGCTTGAGTGTCAGCAACAA为毒力相关基因RpoE(GenBank:NZ_ACZN01000012)基因设计的引物，扩增的片段大小约为16Ibp RpoE-F AGGTGACACTATAGAATATTGCAAAAGGGGTTGAATCTRpoE-R GTACGACTCACTATAGGGACGAGCTTGATGGCTTGAGTT为毒力相关基因dnaj(GenBank:HM215580. I)基因设计的引物，扩增的片段大小约为168bp dnaJ-F AGGTGACACTATAGAATATCGGTGACATTTTTGGTGACdnaJ-R GTACGACTCACTATAGGGAGCGAACCGCTTCTTCTAGTG为毒力相关基因VgrG(GenBank:NZ_ACZN01000017)基因设计的引物，扩增的片段大小约为175bp VgrG-F AGGTGACACTATAGAATAGTTGTTCTTCCCCTCACATVgrG-R GTACGACTCACTATAGGGACGTTGTTCTTCCCCTCACAT为毒力相关基因MviN(GenBank:NZ_ACZN01000012)基因设计的引物，扩增的片段大小约为182bp MviN-F AGGTGACACTATAGAATAGCAATCAACTGACGGGTTTTMviN-R GTACGACTCACTATAGGGAGCGCTGACGTCTTCTTCTTT为毒力相关基因VvgS(GenBank:NZ_ACZN01000009)基因设计的引物，扩增的片段大小约为189bp VvgS-F AGGTGACACTATAGAATATGTGGTAGCTGCTCCTGTTGVvgS-R GTACGACTCACTATAGGGATGGTTGAGTTGCGATTTTCA为毒力相关基因FlgN(GenBank:NZ_ACZN01000009)基因设计的引物，扩增的片段大小约为203bp FlgN-F AGGTGACACTATAGAATACCAGTTTGCCCTGAGTTTGTFlgN-R GTACGACTCACTATAGGGAGCGACTTTGACCAATGATCC为毒力基因相关YihE (GenBank:NZ_ACZN01000010)基因设计的引物，扩增的片段大小约为21Obp YihE-F AGGTGACACTATAGAATAGTTGGCTGAGTCATCCCATTTihE-R GTACGACTCACTATAGGGACTCGAATGCCCTTTAAGCAC为毒力相关基因vcpA(GenBank:JQ345045. I)基因设计的引物，扩增的片段大小约为217bp vcpA-F AGGTGACACTATAGAATAAGCAAAACTCAGGGTTGGTGvcpA-R GTACGACTCACTATAGGGAGGCCATCTTTTGATGGAAGA为毒力相关基因FliL(GenBank:NZ_ACZN01000008)基因设计的引物，扩增的片段大小约为224bp FliL-F AGGTGACACTATAGAATAAGCCGGATCTGACAACAAATFliL-R GTACGACTCACTATAGGGACCTGCTAAGGACGTGATCGT为毒力相关基因PiIQ(GenBank:NZ_ACZN01000006)基因设计的引物，扩增的片段大小约为23Ibp PilQ-F AGGTGACACTATAGAATAAGGAATGTCGCCTAACAACGPilQ-R GTACGACTCACTATAGGGATGGATCTGAATGTCACCCAA 为毒力相关基因LuxS(GenBank:NZ_ACZN01000004)基因设计的引物，扩增的片段大小为238bp LuxS-F AGGTGACACTATAGAATAGCTAAGACA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种溶珊瑚弧菌(Vibrio？coralliilyticus)多重毒力因子GeXP快速检测试剂盒，包括PCR反应试剂，多基因PCR引物和GeXP多重扩增反应试剂，其特征在于，所述的多基因PCR引物包括20对溶珊瑚弧菌多重毒力相关因子的PCR引物和一对通用引物，具体为：为毒力相关基因flhA设计的引物：flhA？F：AGGTGACACTATAGAATATCCATATCAGGGCGAATCTCflhA？R：GTACGACTCACTATAGGGACTTATTCCTGCGGTCCACAT为毒力相关基因TonB设计的引物：tonB？F：AGGTGACACTATAGAATACTCCTCAATCACAGCGTTCATonB？R：GTACGACTCACTATAGGGAGGCTTGAGTGTCAGCAACAA为毒力相关基因RpoE基因设计的引物：RpoE？F：AGGTGACACTATAGAATATTGCAAAAGGGGTTGAATCTRpoe？R：GTACGACTCACTATAGGGACGAGCTTGATGGCTTGAGTT为毒力相关基因DNAJ基因设计的引物：dnaJ？F：AGGTGACACTATAGAATATCGGTGACATTTTTGGTGACdnaJ？R：GTACGACTCACTATAGGGAGCGAACCGCTTCTTCTAGTG为毒力相关基因VgrG基因设计的引物：VgrG？F：AGGTGACACTATAGAATAGTTGTTCTTCCCCTCACATVgrG？R：GTACGACTCACTATAGGGACGTTGTTCTTCCCCTCACAT为毒力相关基因MviN基因设计的引物：MviN？F：AGGTGACACTATAGAATAGCAATCAACTGACGGGTTTTMviN？R：GTACGACTCACTATAGGGAGCGCTGACGTCTTCTTCTTT为毒力相关基因VvgS基因设计的引物：VvgS？F：AGGTGACACTATAGAATATGTGGTAGCTGCTCCTGTTGVvgS？R：GTACGACTCACTATAGGGATGGTTGAGTTGCGATTTTCA为毒力相关基因FlgN基因设计的引物：FlgN？F：AGGTGACACTATAGAATACCAGTTTGCCCTGAGTTTGTFlgN？R：GTACGACTCACTATAGGGAGCGACTTTGACCAATGATCC为毒力基因相关YihE基因设计的引物：YihE？F：AGGTGACACTATAGAATAGTTGGCTGAGTCATCCCATTYihE？R：GTACGACTCACTATAGGGACTCGAATGCCCTTTAAGCAC为毒力相关基因vcpA基因设计的引物：vcpA？F：AGGTGACACTATAGAATAAGCAAAACTCAGGGTTGGTGvcpA？R：GTACGACTCACTATAGGGAGGCCATCTTTTGATGGAAGA为毒力相关基因FliL基因设计的引物：FliL？F：AGGTGACACTATAGAATAAGCCGGATCTGACAACAAATFlIL？R：GTACGACTCACTATAGGGACCTGCTAAGGACGTGATCGT为毒力相关基因PilQ基因设计的引物：PilQ？F：AGGTGACACTATAGAATAAGGAATGTCGCCTAACAACGPilQ？R：GTACGACTCACTATAGGGATGGATCTGAATGTCACCCAA为毒力相关基因LuxS基因设计的引物：LuxS？F：AGGTGACACTATAGAATAGCTAAGACAATGACCACGCCLuxS？R：GTACGACTCACTATAGGGAGTAAAAGCCAGTACGGCAGC为毒力相关基因ToxR基因设计的引物：ToxR？F：AGGTGACACTATAGAATAGGCTTAACTTGCTTTGCGACToxR？R：GTACGACTCACTATAGGGACTAAGCGCGGCTATCAACTT为毒力相关基因hcp基因设计的引物：hcp？F：AGGTGACACTATAGAATAGTGAACAGCAGTCTTGTGCChcp？R：GTACGACTCACTATAGGGAGTCTATCACGGGCGAAACTC为毒力相关基因PilP基因设计的引物：PilP？F：AGGTGAPilPCACTATAGAATAGAGGAAATGCTGGTGATGGTPilP？R：GTACGACTCACTATAGGGATTCACACGTTCGTACCGAGA为毒力相关基因Tol...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈偿，刘助红，高磊，任春华，胡超群，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：
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