本发明专利技术公开了一种副溶血弧菌检测引物，所述检测引物包括外侧上游引物F3外侧下游引物B3、内侧上游引物FIP、内侧下游引物BIP、环状上游引物LF和环状下游引物LB。本发明专利技术还公开了一种贝类副溶血性弧菌的LAMP的检测试剂盒及其应用。本发明专利技术检测方法能快速、简便、准确的检测病原体，而且该检测灵敏度很高，通过对10株副溶血性弧菌和20株其它弧菌进行了扩增，结果显示LAMP检测方法特异性很强；与常规PCR检测方法对照，也显示出很高灵敏性，灵敏度可达88fg/LAMP，另外，LAMP检测方法可通过肉眼直接观察反应所生成的副产物的有无，从而判断反应结果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及水产养殖贝类弧菌检测领域，具体涉及一种贝类副溶血弧菌LAMP检测试剂盒及其应用。
技术介绍
副溶血性弧菌(VibrioParahemolyticus)，为革兰氏阴性杆菌，呈弧状、杆状、丝状等多种形状，无牙孢。进食含有该菌的食物可致食物中毒，也称嗜盐菌食物中毒。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。副溶血性弧菌是一种海洋细菌，主要来源于鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品。此菌对酸敏感，在普通食醋中5分钟即可杀死；对热的抵抗力较弱。目前对于贝类副溶血性弧菌的检测方法有：传统的培养方法、免疫学方法、经典PCR法、实时荧光定量法等。但是，这些检测方法中有的耗时较长，有的操作复杂。迄今在分子水平上对弧菌的检测方法已经取得了很大的进步，各研究表明以PCR扩增为基础的定性、定量的检测方法是切实可行的，并且展现出很大的发展前景。但是，为了保证贝类食品的安全性，迎合快速检测贝类副溶血性弧菌的需求，需要建立更快速、更准确、更灵敏、更特异的检测方法。2000年，日本荣研化学株式会NotomiT等人开发了一种新型的核酸扩增技术-环介导等温扩增技术。该扩增技术能在等温(60-65℃)的条件下，短时间(通常是1h)内可以进行大量的核酸扩增，是一种集简便、快速、精确、低廉等各种优点于一身的基因扩增技术。它与常规的PCR相比较，不需要热变性、循环扩增、电泳观察等过程。LAMP检测方法的特征是针对靶基因上的六个区域设计两对引物(内引物和外引物)，在恒温的条件下利用链置换型DNA聚合酶进行反应，15-60min内便可以实现109-1010倍的扩增反应，并且反应产生大量的焦磷酸镁白色沉淀，直接通过观察白色沉淀来判断扩增是否进行，进而判断靶基因是否存在。环介导等温扩增技术是一种全新的核酸扩增的方法，更具有灵敏度高、特异性强的特点，并且操作简便，不依赖任何专门的仪器设备便可以实现现场高通量快速的检测，检测的成本也远远低于荧光定量PCR。因此，该扩增技术在各指标能媲美于常规PCR，甚至优于常规PCR。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决第一个技术问题是提供一种副溶血弧菌检测引物。本专利技术所要解决的第二个技术问题是提供了副溶血弧菌检测引物在制备检测贝类副溶血弧菌的LAMP检测试剂盒中的应用。本专利技术所要解决的第三个技术问题是提供了贝类副溶血性弧菌的LAMP检测试剂盒在贝类副溶血性弧菌的LAMP检测方面的应用。本专利技术所要解决的第四个技术问题是提供了贝类副溶血性弧菌的检测方法。技术方案：为了解决现有技术存在的问题，本专利技术采用以下技术方案：一种副溶血弧菌检测引物，所述检测引物包括序列表SEQIDNO：1所示的外侧上游引物F3、序列表SEQIDNO：2所示的外侧下游引物B3、序列表SEQIDNO：3所示的内侧上游引物FIP、序列表SEQIDNO：4所示的内侧下游引物BIP、序列表SEQIDNO：5所示的环状上游引物LF和序列表SEQIDNO：6所示的环状下游引物LB。上述的副溶血弧菌检测引物在制备检测贝类副溶血弧菌的LAMP检测试剂盒中的应用。一种贝类副溶血性弧菌的LAMP的检测试剂盒，该试剂盒包括：1)LAMP反应液：其包括：序列表SEQIDNO：1所示的外侧上游引物F3、序列表SEQIDNO：2所示的外侧下游引物B3、序列表SEQIDNO：3所示的内侧上游引物FIP、序列表SEQIDNO：4所示的内侧下游引物BIP、序列表SEQIDNO：5所示的环状上游引物LF和序列表SEQIDNO：6所示的环状下游引物LB；2)阳性对照品；3)阴性对照品。其中，上述LAMP反应液还包括缓冲液、MgSO4、dNTPs、Betaine(甜菜碱)、BstDNA聚合酶。其中，上述检测试剂盒中各种成分的为2.5μL10×缓冲液(含2mMMgSO4)、1.5μL100mM的MgSO4、3.5μL浓度为10mM的dNTPs、0.25μL浓度为25μM的外侧上游引物F3和0.25μL浓度为25μM的外侧下游引物B3、2μL浓度为25μM的的内侧上游引物FIP和2μL浓度为25μM的内侧下游引物BIP、0.5μL浓度为25μM的环引物LF和0.5μL浓度为25μM的环引物LB、0.25μL浓度为1.8M的Betaine、1μL浓度为8U/μLBstDNA聚合酶，用ddH2O补充到总体积为25μL。上述的贝类副溶血性弧菌的LAMP检测试剂盒在贝类副溶血性弧菌的LAMP检测方面的应用。贝类副溶血性弧菌的LAMP检测试剂盒的检测方法包括以下步骤：1)提取样本DNA；2)分别以步骤1)的样本DNA及阴性对照为模板，进行LAMP扩增得到LAMP扩增产物；3)将LAMP扩增产物离心，观察是否有焦磷酸镁白色沉淀，从而判断样本是否为阳性；或者产物进行电泳，根据电泳扩增条带是否有梯形条带，来判断样本是否为副溶血性弧菌。有益效果：与现有技术相比，本专利技术的优点是：1、本专利技术首次设计了一种独特的副溶血弧菌检测引物。本专利技术在设计引物时，尝试了多种基因靶标，针对不同靶基因设计了多对引物，并对每一对引物的特异性和灵敏性进行了检测，经过大量试验筛选、优化，最终确定使用本专利技术所用引物。2、本专利技术方法可以检测感染副溶血性弧菌的样品，特别是用于检测贝类副溶血性弧菌，该检测方法能快速、简便、准确的检测病原体，能在70min内完成检测，而且该检测灵敏度很高，通过对10株副溶血性弧菌和20株其它弧菌进行了扩增，结果显示LAMP检测方法特异性很强；与常规PCR检测方法对照，也显示出很高灵敏性，灵敏度可达88fg/LAMP；3、另外，LAMP检测方法可通过肉眼直接观察反应所生成的副产物的有无，不需要通过显色剂从而判断反应结果。附图说明图1：副溶血性弧菌LAMP产物直观结果：将PCR管离心，管1：阳性(有白色焦磷酸镁沉淀)，管1中箭头所指处显示有白色沉淀，因此可以判定为LAMP反应发生了；2：阴性对照：管2中则没有出现白色沉淀，因此可以判定为LAMP反应没有发生。图2：实施例3的副溶血性弧菌LAMP产物电泳结果；M：2000marker1-10泳道：副溶血性弧菌(共10株)、10泳道：阳性对照、11泳道：阴性对照；将LAMP反应产物电泳后，若出现梯形条带，则说明反应发生，为阳性；若没有出现梯形条带，则表明反应没有发生，为阴性。图中1-10泳道中所加都是以各个副溶血性弧菌DNA为模板的LAMP反应产物，11泳道为阳性对照DNA、而12泳道加入的是以ddH2O为模板的LAMP反应产物。由图可见，1-10泳道以及11泳道均出现梯形条带，而12泳道则没有出现。图3：副溶血性弧菌和其它弧菌LAMP产物电泳结果；1泳道加样是以阳性副溶血性弧菌DNA为模板的LAMP反应产物；2泳道加样为是以采样副溶血性弧菌DNA为模板的LAMP反应产物；而3泳道加入的是以ddH2O为模板的LAMP反应产物空白对照；4～23泳道：其它弧菌DNA为模板的LAMP反应产物(共20株)；图4：LAMP检测方法灵敏度试验结果；用分光光度仪对提取的阳性副溶血性弧菌的DNA测量浓度，所测浓度为441.6ng/μL，每个LAMP反应体系中模板加入量为2μL，因此，不稀释的话相当于一个LAMP体系加入模板量为883.2ng，10倍倍比稀释本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种副溶血弧菌检测引物，其特征在于，所述检测引物包括序列表SEQ ID NO：1所示的外侧上游引物F3、序列表SEQ ID NO：2所示的外侧下游引物B3、序列表SEQ ID NO：3所示的内侧上游引物FIP、序列表SEQ ID NO：4所示的内侧下游引物BIP、序列表SEQ ID NO：5所示的环状上游引物LF和序列表SEQ ID NO：6所示的环状下游引物LB。
【技术特征摘要】
1.一种副溶血弧菌检测引物，其特征在于，所述检测引物包括序列表SEQIDNO：1所示的外侧上游引物F3、序列表SEQIDNO：2所示的外侧下游引物B3、序列表SEQIDNO：3所示的内侧上游引物FIP、序列表SEQIDNO：4所示的内侧下游引物BIP、序列表SEQIDNO：5所示的环状上游引物LF和序列表SEQIDNO：6所示的环状下游引物LB。2.权利要求1所述的副溶血弧菌检测引物在制备检测贝类副溶血弧菌的LAMP检测试剂盒中的应用。3.一种贝类副溶血性弧菌的LAMP的检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括1）LAMP反应液：其包括：序列表SEQIDNO：1所示的外侧上游引物F3、序列表SEQIDNO：2所示的外侧下游引物B3、序列表SEQIDNO：3所示的内侧上游引物FIP、序列表SEQIDNO：4所示的内侧下游引物BIP、序列表SEQIDNO：5所示的环状上游引物LF和序列表SEQIDNO：6所示的环状下游引物LB；2）阳性对照品；3）阴性对照品。4.根据权利要求3所述的贝类副溶血性弧菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应液主要还包括缓冲液、MgSO4、dNTPs、Betaine、BstDNA聚合酶。5.根据权利要求4所...
【专利技术属性】
技术研发人员：王雪鹏，韩风杰，付天增，庞晓茹，李煜，吴佳燕，李启蒙，
申请(专利权)人：南京福海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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