本发明专利技术提供一种检测KRAS基因第2外显子密码子12、13和第3外显子密码子61突变的测序引物对及其试剂盒，属于体外核酸检测领域，所述试剂盒包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶、PCR扩增引物以及测序引物；本发明专利技术提供的试剂盒灵敏度高，特异性好，PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序，操作简便，反应时间短，比金标准——毛细管电泳测序灵敏度高，更适合用于突变分析。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及体外核酸检测领域，采用PCR结合焦磷酸测序技术，用于检测患者组织DNA中KRAS基因型，具体涉及一种定性检测KRAS基因分型的测序引物对及其试剂盒。
技术介绍
RAS基因家族与人类 肿瘤相关的基因有三种——HRASjKRAS和NRAS，其中KRAS对人类癌症影响最大，它好像分子开关当正常时能控制调控细胞生长的路径；异常时该基因永久活化，导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭，使细胞增殖失控而癌变(见图I )。据统计，KRAS突变型结直肠癌患者约占30-40%，在肺癌患者中突变率约占20-30%。NCCN专家组认为，KRAS突变是结直肠癌形成过程中的早期事件，并且原发灶和转移灶的KRAS基因高度保持一致，可用于早期诊断和复发的及时监测。检测KRAS基因突变是深入了解癌基因的情况、了解结直肠癌等恶性肿瘤的发展预后、评估放化疗疗效的重要指标为结直肠癌等恶性肿瘤的早期诊断提供依据科学研究发现，人体内从单个细胞开始到形成米粒大小的肿瘤，需要8 10年，在此阶段人体几乎没有任何症状；从米粒大小的肿瘤发展成杏仁大小的肿瘤，只需I年左右；如果没有及时发现，杏仁大小的肿瘤发展到晚期只需要2 6个月。近几年西妥昔单抗、帕尼单抗等靶向药物(表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂)联合化疗的应用为广大结直肠癌患者带来福音。KRAS基因检测已被写入最新版《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》。新指南传递出了两条重要的信息一是所有转移性结直肠癌患者都应检测KRAS基因状态；二是只有KRAS野生型患者才建议接受EGFR抑制剂如西妥昔单抗和帕尼单抗治疗(见图I)。另外，《09年NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出当KRAS基因发生了突变，则不建议病人使用特罗凯进行分子靶向治疗。为癌症患者的预后提供指导。例如Ryan et al (2003)发表在顶尖杂志⑶T(IF>10)的文章指出，术后血清KRAS基因突变检测对于肿瘤的预后具有重要作用术后血清KRAS基因突变检测阳性者复发率高达63%，而术后血清KRAS基因突变检测阴性者的复发率仅为2%。a. EGFR被TGF a、EGF等配体激活后启动细胞内信号传导，维持细胞存活，促进细胞增殖、转移，在存在血管内皮生长因子(VEGF)的条件下还可促进新生血管生成。b.肿瘤的靶向治疗药物如抗EGFR单抗(西妥昔单抗、帕尼单抗等)通过阻断EGFR二聚体的形成，抑制其下游的细胞内信号传导，从而抑制肿瘤细胞的存活、增殖、转移以及新生血管生成。c. KRAS基因突变可旁路激活细胞内信号传导，从而导致抗EGFR单抗丧失抗癌活性。目前医院用于KRAS基因检测的“金标准”是PCR-直接测序法，但直接测序法的敏感性不高，只能检测出突变细胞比率在10-20%以上的肿瘤组织，对于含〈10%突变细胞的肿瘤组织以及外周血，常规PCR+直接测序法几乎无能为力。相比于直接测序法，焦磷酸测序的灵敏性更高、成本更低。焦磷酸测序(Pyrosequencing)是一种基于聚合原理的DNA测序(确定DNA中核苷酸的顺序)方法，是新一代DNA序列分析技术。它是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。通过分析出峰情况，达到测定DNA序列的目的。目前市场上还没有利用焦磷酸技术进行KRAS的基因多态性检测的产品。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种特异性高、成本低、定量、准确检测KRAS的基因突变的测序引物对及其试剂盒。·为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案一种检测KRAS基因分型的测序引物对，所述引物对为如下引物KRAS1213 正向扩增引物5' -TATAAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3' (SEQ ID NO. I)；KRAS1213 反向扩增引物5' -TATTCGTCCACAAAATGATTCTGA-3' (SEQ ID NO. 2)KRAS1213 测序引物5' -GCACTCTTGCCTACG-3' (SEQ ID N0:3)KRAS6I 正向扩增引物5' -AATTGATGGAGAAACCTGTCTCTT-3; (SEQID NO. 4)KRAS61 反向扩增引物5' -TCCTCATGTACTGGTCCCTCATT-3' (SEQID NO. 5)KRAS61 测序引物5' -CTCGACACAGCAGGT-3' (SEQ ID NO. 6)其中，KRAS1213正向扩增引物(SEQ ID NO. I)和 KRAS61 (SEQ ID NO. 5)反向扩增引物的5'端分别进行生物素标记。一种定性检测KRAS基因分型的测序试剂盒，所述试剂盒包括含有SEQ IDN0. 2所示反向扩增引物的PCR反应液1，含有SEQ ID NO. 4所示正向扩增引物的PCR反应液2，SEQID NO. I所示的正向扩增引物，SEQ ID NO. 5所示的反向扩增引物，SEQ ID NO. 3和SEQ IDNO. 6所示的测序引物；其中，SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 5所示引物的5’端进行生物素标记。进一步地，所述试剂盒中还包括质控品TAYGGTTTGCA (SEQ ID NO. 7) (controloligo)和作为空白对照品的超纯水；质控序列是由QIAGEN设计合成的一段寡聚核苷酸链，用于检测PyroMark Q24测序仪的各项性能指标。进一步地，所述试剂盒还包括KRAS1213阳性对照品1，KRAS1213阳性对照品2，；KRAS61阳性对照品1，KRAS61阳性对照品2 ；所述KRAS1213阳性对照品I为插有SEQ ID NO. 8所示核苷酸序列的KRAS1213野生纯合子质粒；所述KRAS1213阳性对照品2为所述KRAS1213野生纯合子质粒与插有SEQID NO. 9所示核苷酸序列的KRAS1213突变纯合子质粒组成的质粒混合物；所述KRAS61阳性对照品I为插有SEQ ID NO. 10所示核苷酸序列的KRAS61野生纯合子质粒；KRAS61阳性对照品2为所述KRAS61野生纯合子质粒与插有SEQ ID NO. 11所示核苷酸序列的KRAS61突变纯合子质粒组成的质粒混合物；其中，质粒载体为pMD18-T质粒；所述KRAS1213质粒混合物中KRAS1213突变纯合子质粒和所述KRAS1213野生纯合子质粒的数量比为1:1 ;所述KRAS61质粒混合物中KRAS61突变纯合子质粒和所述KRAS61野生纯合子质粒的数量比为1:1。所述的PCR反应液I和PCR反应液2中其他组分为常规的IOx PCR Buffer^dNTPs和H2O,各组分按常规体积比配置(10x PCR Buffer、dNTPs、H20和反应液中引物的体积比为5:3:37. 5:1)。试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂，如由DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种定性检测KRAS基因分型的测序引物对，其特征在于，所述引物对为SEQ？IDNO.1和SEQ？ID？NO.4所示的正向扩增引物，SEQ？ID？NO.2和SEQ？ID？NO.5所示的反向扩增引物，SEQ？ID？NO.3和SEQ？ID？NO.6所示的测序引物；其中，SEQ？ID？NO.1和SEQ？IDNO.5所示引物的5’端进行生物素标记。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：肖芳，
申请(专利权)人：长沙三济生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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